09高效液相色谱法检验操作规程要点分析.doc

目 的：建立高效液相色谱法的标准操作规程。本规程适用于高效液相色谱法。QC主任中国药典2010年版。μm之间。粒径更小（2μm）的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm）。 使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。当对其测定结果产生争议时，应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。 以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40℃，为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜超过60℃。 流动相的pH值应控制在2～8之间。当pH值大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH值小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH值大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖的键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH值小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂，有机无机杂化填充剂等。 1.2 检测器 最常用的为可变波长的紫外-可见光检测器，包括二极管阵列检测器、其他常见的检测器有荧光检测器、电化学检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、质谱检测器等。 紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应；蒸发光散射检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关；二极管阵列检测器可以同时记录待测物的吸收光谱，故可用于待测物的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。 紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与与待测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与与待测溶液的浓度通常呈脂数关系，故进行计算时，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同，如采用紫外-可见光检测器，所用流动相应符合紫外-可见分光光度法项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截取使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发性盐组分的流动相。 1.3 流动相 反相色谱系统的流动相首选甲醇-水系统（采用紫外末端波长检测时，首选乙腈-水系统），如经试用不适合时，再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有缓冲液的流动相，必要使用时，尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相。由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为因定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。 各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应供试品并达到系统适用性试验的要求。其中，调整流动相组分比例时，以组分比较低者（小于或等于50%）相对改变量不超过±30%且绝对改变量不超过±10%为限，如30%相对改变量的数值超过10%时，则改变量以10%为限。 对于必须使用特定牌号的填充剂方能满足分离要求的品种，可在该品种项下说明。 2 系统适用性试验 系统适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个参数。其中分离度和重复性尤为重要。 按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。 2.1 色谱柱的理论板数（n） 用于评价色谱柱的性能，由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质，一般为待测组分或内标物质的理论板数。 在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和峰宽（W）或半峰高宽（Wh/2），按n=16（tR/ W）2或 n=5.54（tR/ Wh/2）2计算色谱柱的理论板数。如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。 2.2 分离度（R） 用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测定待测组分与某一添加的指标性成分(内标物质或其他难分离物质)的分离度，或将 供试品或对照品用适当的方法降解，通