分子量及酰基供体对酶促魔芋葡甘聚糖酰化反应的影响..docVIP

分子量及酰基供体对酶促魔芋葡甘聚糖酰化反应的影响 摘 要 研究了在有机介质叔丁醇中魔芋葡甘聚糖（KGM）的分子量及酰基供体对固定化脂肪酶NoVoZym435 催化KGM 乙酰化反应的影响. KGM 的分子量对酶促其酰化反应的活性及产物取代度有显著影响. 随着KGM 分子量的增大，酶催化反应的速率逐渐下降，产物的取代度逐渐减小. KGM 分子量对该反应的影响与不同分子量KGM 的溶解度、体系粘度、空间位阻及颗粒形态等因素有关. 以不同链长的脂肪酸乙烯酯为酰基供体时，随着酰基供体中脂肪酸碳链的增长，酶促KGM 酰化反应速率逐渐下降，产物的取代度逐渐减小，且该酰化反应具有高度的区域选择性，反应均发生在C6- OH 上. 关键词：魔芋葡甘聚糖 酰化反应 区域选择性 脂肪酶 分子量 酰基供体 前 言 魔芋葡甘聚糖（KGM）是一种来源于植物魔芋的天然多糖，由D- 葡萄糖和D- 甘露糖（按摩尔比约1／1. 6 ）通过!-1 ， 4- 吡喃糖苷键结合而成，在其主链甘露糖的C3 位置上往往存在着通过!-1 ，3糖苷键结合的支链结构；天然KGM 分子除含葡萄糖和甘露糖外，可能还有微量的乙酰基存在［1 !3］. KGM 具有优良的生物相容性、可生物降解性和独特的理化 性质. KGM 改性后因修饰基团的性质不同而具有不同的用途，可作为一种新型药物［4 ，5］、环境友好的表面活性剂［6 ］或药物载体［7 ］等.糖酯可用化学方法合成，但传统的化学合成常在高温条件下进行，反应条件苛刻，且反应的区域选择性较低［8 !10］. 此外，化学方法合成的糖酯颜色较深（深褐色），且常因含有一些有毒的化学物质而难应用于化妆品、食品和医药工业. 与化学方法相比，酶法合成不但简单易行，环境友好，而且区域选择性高［9］. 相对于小分子单糖而言，国内外对多糖高分子化合物生物转化的研究甚少. 我们曾对有机介质中酶促KGM 乙酰化反应进行过研究，并考察一些因素（如有机溶剂、反应初始水活度、摇床转速、温度和酶浓度）对酶促酰化反应的影响规律［11］. 随着分子量的增大，高分子化合物的理化性质与其单体小分子化合物的差异逐渐加大，故以其为底物的生物催化反应的特性也将呈现出明显的差异. 另据报道，不同分子量的KGM 经修饰后得到的产物具有不同的理化性质和应用价值［4 -17］. 因此，探讨KGM分子量大小对酶促KGM 酰化反应的影响规律具有重要的理论和实际意义. 迄今，有关这方面的研究国内外尚未见有文献报道. 本文主要探讨有机介质叔丁醇中KGM 分子量及酰基供体对固定化脂肪酶NOVOZym 435 催化KGM酰化反应的影响. 其目的在于揭示底物分子量对酶促酰化反应的影响规律，丰富对酶反应、酶识别等酶学理论问题的认识；并合成具有不同分子量、不同理化性质和应用范围的KGM 酰化产物. . 1 实验部分 1.1 酶及主要试剂 NOVOZym 435（10 U／mg ）购自丹麦NOVOZymes公司，固定化于大孔丙烯酸树脂；天然KGM 样品（MW=980 000 ）由海南多环保健品有限公司北海分公司赠送. 不同分子量的KGM 样品由酶法降解制得［12］. KGM 样品使用前充分研磨，过120 目筛，备用. 乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯和硬脂酸乙烯酯购自Aldrich 公司，纯度均为99 % 以上. 其他试剂均为市售分析纯试剂. 1.2 酶促KGM酰化反应 在25 ml 带塞的三角瓶中分别加入0. 4 g（含2. 5 mmOl 糖单元）的KGM，0. 24 g 的NOVOZym435 ，7. 5 mmOl 脂肪酸乙烯酯和10 ml 叔丁醇（初始水活度0. 75 ），置于水浴恒温振荡器中（50 C，150!200 r／mi n ）反应一定时间. 反应体系初始水活度（aW）的控制及产物分离参见文献［11 ］. 反应体系粘度采用美国BrOOkfield 公司DV-I 型旋转式粘度计测定. KGM 酰化产物的取代度（DS）用皂化法测定［11］. 根据下式分别计算KGM 酰化产物的酯化率（C）和产物的取代度（DS） C=（Va -Vb）·N（HCI ）·M（RCO- ）/1000·ms DS= 162·C/M（RCO- ）-（M（RCO- ）-1 ）·C 式中，Va为滴定空白样品所消耗的HCl 溶液的体积（ml ），Vb为滴定被测样品所消耗的HCl 溶液的体积（ml ），N（HCl ）为HCl 标准溶液浓度（mOl／L），M（RCO- ）为酰基供体中酰基RCO- 的摩尔质量（g／mOl ），ms为被测样品的质量（g）.每个样品同时做3 个平行试样，取平均值为测定结果. 用该法测