ppt课件-讲几个实验技术的技巧性.ppt

实验二 RNA提取、  逆转录PCR * * （8：00~8：05） 实验回顾 实验一、基因组DNA的提取、 酶切及电泳 目的 DNA片段 质粒 TA载体 连接 重组质粒 目的 DNA 转化 无质粒的E.Coli 死亡 有质粒的E.Coli 存活 含抗生素培养基中生长 PCR 2-3min 平板筛选 实验二 RNA提取、逆转录PCR 实验内容 1、小鼠肝脏组织总RNA的提取； 2、RNA的琼脂糖凝胶电泳； 3、以总RNA为模板的逆转录反应； 4、以cDNA为模板的特定基因的RT-PCR: 注：本次实验扩增GAPDH基因(746bp) 5、 PCR产物的电泳及回收 （8：05~8：15） 总RNA 真核细胞的RNA主要分为： 1、mRNA: 1-5% 起始密码：AUG 终止密码：UAA,UAG,UGA。 5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。 1）免受核酸酶破坏， 2）起始、促进蛋白质合成。 3`poly(A)尾巴结构 20--200个A. 翻译所必需。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基40S: 18S=1874nt RNA提取操作注意事项 RNA分离的关键因素是减少RNA酶污染。 RNA酶是一类自然界中广泛存在、生物活性非常稳定的酶类。环境中的灰尘、人体汗液、唾液、实验器材表面。RNase耐热、耐酸、耐碱，不需要辅助因子就具有活性作用。 1、尽量避免外源性RNase 污染 a. 操作环境空气洁净。带手套、口罩。 b. 用新开封的化学试剂。（试剂应该专用） c.一次性塑料器材最好是新开封并经过DEPC水处理及高压灭菌。 d.玻璃器材、水都应该经过去RNase 处理。对玻 璃器材还应该进行高温烘烤。 2、应用RNase 抑制剂抑制内源性RNase 活性。 1）将1 ml Trizol 试剂分装到Eppendorf 管中备用。 2）实验教师操作: 取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。 3）将研磨后的组织（小米粒大小）转移至1 ml Trizol 试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2 min以上，使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。 4）室温孵育10 min。 （8：15~9：05） 发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。 强调肝脏组织块不宜过大,研磨要彻底。 第一部分：提取小鼠肝脏组织的总RNA 1、异硫氰酸胍法： GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性 Rnase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。 特点：需低温操作，但价格经济。 2、Trizol 试剂（商品化产品） 特点：在室温下可以提取细胞总RNA， 具有简单、快速、提取量大、纯度高的优点。 3、mRNA提取试剂盒 真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。 课间介绍 RNA提取的几种方法 室温孵育10 min RNase抑制剂介绍 1、DEPC, 二乙基焦炭酸盐 RNA操作时最常用的RNase抑制剂，对核酸酶有 很强的抑制作用。作用机制是与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。 使用方法：用来去除溶液中的RNase 。RNA提取中 所有液体试剂都应该用DEPC处理。 有效浓度：0.05%---0.1%，室温磁力搅拌20分钟。 灭活条件：高压消毒，或70 ?C 1 h。 在Tris溶液中半衰期为1