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DNA提取及常见问题分析 内容 前言 DNA提取的几种方法 DNA提取的几种方法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－SDS法 基因组DNA－SDS法 基因组DNA－其它方法 　物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 　化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 　生物方式：酶法 基因组DNA－其它方法 　吸附材料结合法： 基因组DNA－其它方法 　浓盐法： 　　　　　　 　 　有机溶剂抽提法： 　　　　 　 　密度梯度离心法： 　　　　　　　 质粒DNA－碱裂解法 质粒DNA－碱裂解法 质粒DNA－煮沸法 细胞器DNA－差速离心法 内容 DNA提取的基本步骤 材料准备 细胞裂解 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸沉淀、溶解 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 谢谢大家！ 材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融 原因 对 策 尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融 问题二：DNA降解。 实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全 洗涤时DNA丢失 原因 对 策 尽量选用新鲜（幼嫩）的材料 动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁 高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量） 低温沉淀，延长沉淀时间 加辅助物，促进沉淀 洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒 问题三：DNA提取量少。 * * * 北京天为时代科技有限公司 主讲人：刘召华 第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题、 　　　　　原因分析及其对策 第一部分：DNA提取方法简介 　　　DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此DNA的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。 　染色体DNA的提取 　CTAB法 　SDS法 　其它 　非染色体DNA的提取 　质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法　 　线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法 　CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。 　CTAB提取缓冲液的经典配方 20 mM 　EDTA （pH8.0） 0.1%（V/V）使用前加入 2%(W/V) 1.4M 100 mM 终浓度 β-巯基乙醇 CTAB NaCl Tris-HCl （pH8.0） 组份 Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 　CTAB提取缓冲液的改进配方 5%(W/V) PVP40 20 mM 　EDTA （pH8.0） 2%（V/V）使用前加入 3%(W/V) 1.4M 100 mM 终浓度 β-巯基乙醇 CTAB NaCl Tris-HCl （pH8.0） 组份 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 　CTAB法流程图 植物材料 裂解液 上层溶液 液氮研磨 抽提 细胞裂解 干燥溶解 离心洗涤 酒精沉淀 DNA溶液 SDS法原理 SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。