基础生物化学-核酸的结构与功能.ppt

1.3 核酸的理化性质及其应用 1.3.1 核酸的一般性质 ①RNA为白色粉末状，DNA是白色纤维状固体，二者均溶于水，而不溶于一般有机溶剂中，故常用冷乙醇从水溶液中将核酸沉淀出来。 ②核酸是两性电解质，但酸性强，与金属离子结合成盐，也可与碱性蛋白结合；介质pH大于4时，呈阴离子，电泳时向阳极移动；DNA在pH4～11间最稳定，超出此范围易变性。 ③大多数DNA为线性分子，长度可达数厘米，直径仅为2nm，故DNA溶液粘度很高，分子极易断裂；RNA溶液粘度较小。 1.3.2 核酸紫外吸收 核酸分子中的嘌呤和嘧啶碱基中含有共轭双键体系，因而具有特殊的紫外吸收光谱，其最大吸收峰位于260nm处。利用这一性质可定量测定核酸的含量或鉴定核酸的纯度。 纯DNA：OD260/OD280 = 1.8 纯RNA： OD260/OD280 = 2.0 样品中如含有蛋白质及苯酚等杂质，此比值明显降低。对于纯样品，读取OD260值即可算出含量；通常以1单位OD值相当于50?g/ml双螺旋DNA或40?g/ml单链DNA（RNA），或20?g/ml寡核苷酸计算。此方法简便、快速、准确。 1.3.3 核酸的变性和复性 1.3.3.1 核酸的变性（denaturation） ⑴概念 核酸的变性是指因某些理化因素的影响使维持核酸空间结构的氢键和疏水键断裂，双螺旋结构解体，但不涉及核 苷酸间共价键的断裂。 核酸变性后，粘度降低，紫外吸收值增高(增色效应)，生物功能消失。 ⑵影响变性的因素 破坏双螺旋稳定性的因素都可使DNA变性。 DNA分子中的碱基处于配对和不配对的动态平衡状态，很多因素会引起它向不配对方向转变，即引起DNA变性。如高温、强酸、强碱、有机溶剂、尿素、酰胺等试剂、射线等。 高温：DNA稀盐溶液加热到80~100℃，几分钟内双螺旋键即解开，形成无规则的线团。 离子强度：提高溶液的离子强度，可中和DNA分子链上磷酸基团的负电荷，降低它们之间的排斥力，稳定DNA的结构。DNA通常保存在1molNaCl中。 极端的pH值：pH﹤1时，DNA的磷酸二酯键会被水解；pH﹥11.3时，DNA的所有氢键断裂。 疏水作用：甲醇可增加碱基的溶解度，三氟醋酸钠可降低DNA分子的疏水作用，破坏双螺旋结构引起变性。 尿素及甲酰胺：它们可与碱基之间形成氢键。 碱基堆积：氢键和碱基堆积是一致的，碱基堆积是一种协同作用，处于中间的碱基比两边的碱基稳定，线状双链DNA分子的两端常有7个未配对的碱基，因此少于15bp的双链DNA片段极不稳定。 ⑶DNA的熔点（ Tm ） DNA的热变性过程中一半分子发生变性时的温度称为DNA的解链温度( melting temperature，简写Tm)或熔点，用 Tm 表示。DNA的Tm值一般在70~85℃之间。 热变性是在很狭的温度范围内突发的跃变过程， 很像结晶达到熔点时的熔化现象，故名熔解温度。 ⑷DNA本身性质决定了Tm ①DNA的均一性 DNA分子中碱基组成的均一性：只含有一种碱基对的多核苷酸片段，比天然DNA的Tm值范围窄。因它在变性时的氢链断裂几乎可“齐同”进行，故所要求的变性温度更趋于一致。 待测样品DNA的组成是否均一：如样品中只含有一种DNA，其Tm值范围较窄， 若混杂有其它来源的DNA，则Tm值范围较宽。原因也与DNA的碱基组成有关。 ②DNA的(G+C)含量 Tm值的高低取决于DNA分子中的(G+C)的含量。(G+C)含量越高，Tm值越高。 G-C碱基对有3对氢键，A-T碱基对有2对氢键，DNA中(G+C)含量高能增强结构的稳定性，破坏G-C间氢键需比A-T氢键付出更多的能量，故(G+C)含量高的DNA，其变性Tm也高。 一定离子强度下(DNA溶于0.2mol/L NaCl): Tm与(G+C)含量(X) 的关系可用经验公式表示： ?X%(G+C)=2.44(Tm-69.3) RNA也有螺旋-线团之间的转变，但由于RNA只有局部螺旋区，所以热变性没有DNA那样明显， Tm值较低。tRNA结构中螺旋区较多， Tm值较高。 1.3.3.2 核酸的复性（renauration） ⑴概念 变性DNA在适当的条件下(除去变性因素)，可使两条分开的链按照碱基配对规律重新缔合成双螺旋结构，这一过程称为复性。复性后的DNA其理化性质和生物功能都得到部分恢复。复性的DNA溶液紫外吸收下降称为减色效应。 ⑵影响复性的因素 热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为 退火。 退火也用以描述杂交核酸分子的形成。DNA的复性不仅受温度影响，还受DNA自身特性等其它因素的影响。 1.3.3.3 分子杂交 DNA酶法序列分析的原理 酶反应 电泳方向 模板 CCGGTAGCAACT 3′