免疫学概论第5章抗原和抗体的制备与应用.ppt

* * * * * * * * * * 步骤 9单克隆抗体的大量制取 腹腔接种 1.辛酸硫酸铵沉淀法 原理：先加正辛酸沉淀杂蛋白，后加硫酸铵 沉淀抗体。 特点： 成本较低，操作简单； 抗体活性损失小； 抗体纯度高； 抗体回收率低； 需要高速冷冻离心机。 步骤 10单克隆抗体的纯化 2 亲和层析法： 原理：利用蛋白A或蛋白G通过共价键联接到活化的固相载体上，吸附抗体，然后采用改变pH值的方法将抗体洗脱分离。 特点： 抗体纯度高； 纯化速度快； 抗体回收率低； 抗体活性有损失； 成本高，费用大。 单克隆抗体的优缺点 优点 ： 在体外“永久”地存活并传代 用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法 可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗 局限性 ： 固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围 反应强度不如多克隆抗体 制备技术复杂、费时费工、价格较高 制备过程中注意事项 1 2 3 4 用于免疫的动物，应选择与亲本骨髓瘤细胞同一品系的动物 抗原免疫用的抗原尽量设法提高其纯度，并保存其活性 融合剂PEG对细胞有毒性，一般采用分析纯规格。浓度越高，对细胞 的毒性越大 操作中的污染污染是杂交瘤技术中最常遇到的问题，它往往可使一个即将建株的细胞毁于一旦。 单克隆抗体的 特点 特异性强 高度的均一性和重复性 效价高 可无限供应 具有单一的生物学功能 对环境敏感 　 　　 单克隆抗体和多克隆抗体的比较 比较项目 多克隆抗体（PcAb） 单克隆抗体（MAb） 免疫原要求 免疫原纯度高，抗体 纯度才能高 不纯的免疫原可以获得高纯度抗体 抗体产生细胞 多克隆性 单克隆性 均质性 高度异质 高度纯质 特异性 较高，与抗原上多种决 定簇结合 高，与抗原上特定决定簇结合 稳定性 较好 相对较差，对理化条件敏感 标准化 较难，不同批次的抗体质 量差异大 易于标准化，批次间差异小 交叉反应 很常见，难避免非特异性 反应 不常见，可避免非特异反应 沉淀反应 有 多数没有 实用的血清学试验 大多数血清学试验 一种或多种，需适当选择 供应量 有限 无限 有效抗体含量 0.1-0.2 mg/ml 小鼠腹水2.0-30 mg/ml 无效Ig含量 10.0-15.0 mg/ml 体外培养一般没有，小鼠腹水0.5-5.0 mg/ml 其它血清蛋白 存在 体外培养可能有少量小牛血清蛋白，小鼠腹水有少量杂蛋白 * * * * * * * * * * * 在撞击下爆炸性分解：理论上每克叠氮化钠分解可以产生517毫升的氮气 * * * * * * * * * * * * * * 二 、多克隆抗体的特点 特点: 不均一性 (抗体的异质性), 由外源性和内源 性因素引起的 1) 外源性: 抗原分子结构复杂, 具有多种抗原 决 定簇, 每种决定簇引起一种相应抗体的 产生. 反映了机体对抗原物质的精细结 构的识别能力. 2) 内源性: 免疫球蛋白的血清型(回顾) 　　　 免疫蛋白为大分子蛋白质，具备抗原的各种性质，对异种、同种异体，甚至宿主自身都是良好的抗原，且是一个抗原复合体，带有多种抗原决定簇。Ig分子的这种异质性反映了抗体形成细胞的遗传性差异，代表抗体分子在不同水平上的遗传变异性；通常可用血清学方法检测出来，并据此将Ig及其肽链（H和L链）分成不同的血清学类型。 同种型 同种异型 独特型 免疫球蛋白的血清型: 三、多克隆抗体的制备流程 1.免疫动物的选择 2.免疫的方法 3.动物采血法 4.免疫血清的分离与保存 一、免疫动物选择 能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。 兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。 1.抗原与免疫动物种属差异越远越好； 2.动物必须适龄、健壮、无感染的正常动物、 体重合乎要求； 3.不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫 应答； 4.按需要量选择大小不同的动物。 二、免疫方法 4.免疫方案 ①全量免疫法：弗氏佐剂抗原多次注射 ②微量免疫法：