DNA复制解析.ppt

DNA复制的一般特征 以原来的DNA两条链作为模板，四种dNTP为前体，还需要Mg2＋ 作为模板的DNA需要解链 半保留复制 需要引物——主要是RNA，少数是蛋白质 复制的方向始终是5′→3′ 具有固定的起点 多为双向复制，少数为单向复制 半不连续性 具有高度的忠实性和进行性 DNA复制起始区的特征 由多个短的重复序列组成； 能够被多亚基的复制起始区结合蛋白识别； 通常富含AT碱基对，这有利于DNA复制起动时的解链，因为AT碱基对含有的氢键数目低于GC碱基对。 Cairns的实验 复制开始时，将大肠杆菌放在含低剂量的[3H]-dT的培养基中培养几分钟；随后，将细菌转移到含高剂量的[3H]-dT的培养基中继续培养一段时间；最后，收集细胞，小心地裂解以抽取其中的染色体DNA进行放射自显影。如果是单向复制，自显影图谱上银颗粒的密度应该是一端高、一端低；如果是双向复制，则应该中间是一段低密度的银颗粒，两侧是高密度的银颗粒。低密度银颗粒意味着这一段DNA属于复制起始区，高密度颗粒代表的是后来合成的。 Reiji Okazaki的实验 脉冲标记——目的在于即时标记在特定时段内合成的DNA。 脉冲追踪——目的则是要弄清那些被标记上的DNA片段后来的去向。 参与DNA复制的主要酶和蛋白质的结构与功能 DNA聚合酶 DNA解链酶 单链结合蛋白 DNA引发酶 DNA拓扑异构酶 DNA连接酶 端聚酶（真核生物特有） DNA聚合酶 DNA聚合酶的全名是依赖于DNA的DNA聚合酶，就是以DNA为模板，催化DNA合成的聚合酶。 DNA聚合酶是参与DNA复制的主要酶，该酶的许多性质直接决定了DNA复制的一些基本特征。 DNA聚合酶 反应通式： Mg2+ DNA + 引物-OH + dNTP DNA/引物-dNMP + PPi 5′ 3′ 随后的 PPi迅速水解驱动反应的进行 原核生物DNA 聚合酶 DNA pol I,II,III,IV和V 真核生物DNA 聚合酶 DNA pol α,β,γ,δ和ε以及更多 DNA 聚合酶I是不错，然而…. 1969年，John Cairns和 Paula deLucia -分离到一种大肠杆菌突变株，其DNA聚合酶I活性只有野生型的1% (polA基因突变) - 突变体对UV辐射极为敏感 - 其他一切正常 - 细胞能够分裂 结论: DNA聚合酶I不是大肠杆菌DNA复制的主要聚合酶 其他线索…. 速度太慢 酶量太多 进行性不够高——聚合酶的进行性是指一种聚合酶从与DNA模板结合到与模板解离的这段时间内催化参入到DNA链上的核苷酸数目。显然，DNA聚合酶的进行性越高，催化复制的效率就越高。聚合酶I的进行性平均值为20nt~50nt，远远低于实际值。 结论：一定有其他DNA聚合酶。生化学家很快从polA突变体纯化到新的DNA聚合酶 DNA聚合酶I的功能究竟是什么？ - 在多种需要短DNA合成的过程中起作用 在DNA修复中起主要作用 在DNA复制中，去除RNA引物，并填补随后留下的空缺。 对DNA聚合酶I更多的认识 为什么具有3′→5′外切核酸酶? 充当校对的功能 去除复制中错配的核苷酸，然聚合酶有机会重新合成正确配对的核苷酸 DNA聚合酶家族 已在大肠杆菌中发现5种不同的DNA聚合酶 DNAP I: 占聚合酶总活性的90% DNAP II: 在DNA修复中起作用(1999年得到证明) DNAP III: 主要的DNA复制酶 DNAP IV: 在DNA修复中起作用（在1999年发现） DNAP V:在DNA修复中起作用（在1999年发现） DNA聚合酶III “真正”的大肠杆菌DNA复制酶 快：1 000nt/秒/酶 进行性高： 500 000nt 酶量合适 精确 温度敏感型突变体——只能生存在允许温度（30℃）下，当温度上升到限制温度（45℃）时，大肠杆菌难以生存。究其原因，是因为编码聚合酶III α亚基的polC基因发生了突变，致使该酶对温度变化极为敏感。当环境温度超过30℃以后，就很容易变性而丧失活性，这时DNA复制不能正常进行；而在允许温度下，该酶的活性是正常的，DNA复制也很正常。 真核细胞的DNA聚合酶 已在真核细胞中发现至少15种以上的DNA聚合酶，除了5种发现较早的DNA聚合酶α、β、γ、δ和ε以外，其它几种DNA聚合酶如聚合酶θ、ζ、η、κ、ι、μ、λ、ψ和ξ都有相关的报道，这些新发现的DNA聚合酶一般缺乏3′-外切酶的活性（θ除外），因此没有校对的功能，它们主要参与DNA的跨越