酶活力的测定 国标酶活力的测定 国标.doc

木瓜蛋白酶活力的测定 一、试剂与溶液 1. 三氯乙酸 称取三氯乙酸6.54g，用水溶解并定容至100mL。 2. L-酪氨酸标准储备溶液（100μg/mL） 精确称取L-酪氨酸0.1000g，用1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸溶液。 吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。 3. 氢氧化钠溶液（20g/L） 称取氢氧化钠2g，加水搅拌溶解。待溶液到室温后 ，以水定容至100mL，搅拌均匀。 4. 盐酸溶液 1mol/L:取22.5ml的浓盐酸溶液，加水定容至250ml。 0.1mol/L：取1.8ml的浓盐酸溶液，加水定容至200ml。 5. 酪蛋白溶液（10.0g/L） 称取标准酪蛋白1g，用少量氢氧化钠溶液润湿，加入相应的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中100℃加热回流30min。冷却到室温后转入100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为3d。使用前重新确认并调整pH至规定值。 二、 分析步骤 1. 标准曲线的绘制 L-酪氨酸标准溶液：按表1配制。L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。 表1 L-酪氨酸标准溶液 管号 酪氨酸标准溶液 （μg/mL） 酪氨酸标准储备液体积 （mL） 加水体积 （mL） 0 0 0 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 7 4 40 4 6 5 50 5 5 分别取上述所配的溶液，以0管为空白，利用紫外分光光度计于波长275nm下测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。利用回归方程，计算出吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值。其K值应在130~135范围内，如不符合，需重新配制试剂，进行实验。 2. 样品的测定 待测酶液的制备：称取酶样品1g。然后用磷酸缓冲溶液充分溶解，定容至50ml。 测定：先将酪蛋白溶液置于（40±0.2）℃恒温水浴中，预热5min，然后按以下流程操作：试管A（空白） ↓ 加酶液2.00mL ↓（40±0.2）℃，2min 加三氯乙酸4.00mL（摇匀） ↓（40±0.2）℃，10min 加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀） ↓ 取出静止10min，过滤 （慢速定性滤纸） 定容至100ml ↓ 测滤液吸光度 试管B（酶试样，需三个平行样） ↓ 加酶液2.00mL ↓（40±0.2）℃，2min 加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀） ↓（40±0.2）℃，10min 加三氯乙酸4.00mL（摇匀） ↓ 取出静止10min，过滤 （慢速定性滤纸） 定容至100ml ↓ 测滤液吸光度三、计算过程 从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/mL。样品的酶活力按下式计算： X2= (X1×V×n×8)/(2×m ×10) 式（1） 式（1）中： X1—由标准曲线所得的样品最终稀释液的酶活力，u/mL； X2—样品的酶活力，u/g； V—溶解样品所使用量瓶的体积，mL； n—稀释倍数； 8—反应试剂的总体积，mL； 2—吸取酶液的体积，mL； m—样品的质量，g； 1/10—反应时间10min，以1min计。 1、标线的绘制 管号 酪氨酸的浓度（μg/mL） 吸光度A 峰所在的波长λ(nm) 1 10 0.0850 274 2 20 0.1504 274 3 30 0.2329 724 4 40 0.3011 274 5 50 0.3785 274 ∵吸光度A=1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值 ∴求得K=134.0135 2、样品的测定 管号 吸光度A 峰所在的波长λ 由标线所得浓度 C（μg/mL ） 空白 没有峰 平行1 0.2160 273 28.07 平行2 0.2160 273 28.07