胃癌患者外周血中CK―19的表达及其临床意义.docVIP

胃癌患者外周血中CK―19的表达及其临床意义 　　[摘要] 目的 检测胃癌患者外周血中CK-19和MUC-1的表达，确定其作为早期胃癌微转移分子标志物的可能性；讨论CK-19 mRNA对早期胃癌微转移的临床诊断意义。 方法 研究对象共分为三组，其中2009年3月～2012年3月期间于陕西省安康市中心医院住院的96例初治胃癌患者作为实验组，30例胃良性疾病患者和30例健康人的外周血分别作为对照组。采用RT-PCR法检测实验组及对照组的外周血中CK-19 mRNA及MUC-1 mRNA的表达情况并评估目的基因的表达与临床特征的相关性，对结果进行统计学分析，选取出合适的标本进行PT-QPCR实验。RT-QPCR法检测44例早期胃癌患者外周血中CK-19 mRNA的表达量，通过绘制ROC曲线，探索诊断效果最好的临界值并计算AUC。 结果 ①实验组和对照组中CK-19 mRNA阳性表达率分别为53.13%（51/96）、1.67%（1/60），差异有高度统计学意义（P 0.05）。②本实验结果统计的临界值为0.2358，灵敏度为95.45%，准确度为77.37%；AUC为0.897。 结论 RT-QPCR法检测外周血中的CK-19 mRNA，适合作为诊断早期胃癌微转移的重要参考指标。 　　[关键词] 胃癌；CK-19；RT-QPCR；外周血 　　[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）05（b）-0004-04 　　胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，有发病率高、转移率高、病死率高、早期诊断率低、根治切除率低、5年生存率低等特点。胃癌的死亡大多由于手术及化疗后的复发和转移，因此肿瘤微残留或微转移是影响胃癌患者预后的重要因素。RT-PCR已广泛应用于检测肿瘤患者在外周血、淋巴结、骨等病灶的微转移，且显示了较高的敏感性和特异性[1]。在影像学意义上，当肿瘤细胞还没有形成转移结节前，某些肿瘤相关标志物就会出现在外周血内。因此，选择合适的RT-PCR扩增标志物是关键之处。角蛋白家族（CK）及多形上皮细胞粘蛋白（polymorphic epothelial mucin）是目前研究较多的胃癌微转移肿瘤标志物[2]，二者都在上皮来源的恶性肿瘤中有表达。CK-19作为细胞角蛋白家族的一种主要分布于上皮组织内，是构成细胞骨架的中间微丝[3]，其已被认为是检测循环癌细胞的敏感标志物[4]。MUC-1是多形上皮细胞黏蛋白（polymorphic epothelial mucin）的核心蛋白基因，已有人将其应用于RT-PCR检测乳腺癌细胞淋巴结微转移[5]。本研究用荧光定量RT-QPCR方法探讨早期胃癌患者外周血CK-19 mRNA及MUC-1 mRNA的表达的意义。 　　1 材料与方法 　　1.1 标本采集和保存 　　采集陕西省安康市中心医院2009年3月～2012年3月期间住院的96例初治胃癌患者，男56例，女40例；腺癌37例，鳞癌23例，腺鳞癌21例，其他类型15例；年龄60岁71例，≤60岁25例；分期Ⅰa期13例，Ⅰb期24例，Ⅱ期59例；并采集30例胃良性疾病患者和30例健康人的外周血作为对照组。比较三组人群在年龄、病理类型、性别和原发部位等一般情况，其差异不存在统计学意义（上述4个因素均P 0.05，表2）。胃腺癌MGC-803细胞株为本单位保存。血液标本均为空腹外周静脉血，负压抽取，并弃首1 mL，以防上皮细胞污染标本，后抽取约1 mL 外周血标本（肝素抗凝）。将血液标本和对照细胞抽提总RNA后逆转录成cDNA分成2份，于-20℃冻存保存，在6个月内进行下一步的RT-PCR反应。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 外周血总RNA的抽提 外周血中总RNA用吸附柱抽提后，通过紫外分光光度法和1%琼脂糖凝胶凝胶电泳检测RNA，确定其浓度、纯度及完整性。由Genebank中查得相应序列，并查阅相关文献[6-7]，设计CK-19 mRNA及MUC-1 mRNA的引物，3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）内参照引物，由Takara生物科技公司合成，序列如下：CK-19 mRNA （正义链）：5’-AGGTGGATTCCGCTCCGGGCA-3’；CK-19 mRNA（反义链）：5’-ATCTTCCTGTCCCTCGAGCA-3’；扩增片段460 bp；MUC-1 mRNA （正义链）：5’- ATGCCAGTAGCACTCACCATAG -3；MUC-1 mRNA （反义链）： 5’-CAGCCAAGGCAATGAGATAGAC -3’；扩增片段 510 bp；GAPDH （正义链）：5- ACCACAGTCCATGCCATCAC -3’；GAPDH（反义链）：5- TCCAC