第三章、基因工程常用受体细胞课件.ppt

第三章：基因药物体外表达的受体细胞 第一节、宿主细胞选择原则 1、容易获得较高浓度的细胞； 2、安全，不致病； 3、遗传背景清楚，容易进行DNA重组操作及遗传改造； 4、产物的产量高（表达水平和稳定性） 、生物活性高 5、产物容易提取纯化。 6、容易进行代谢调控； 7、易培养（生长速度、营养需求、氧耗量等），培养成本低 第二节、宿主细胞分类及特点 分类：原核细胞（大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等） 真核细胞（酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞） 一、原核表达系统的特点 （一）优点： 1、 结构简单，基因组成及功能相对清楚，易于遗传操作及转化 2、生理代谢途径及表达调控机制相对清楚，便于表达调控 3、生长迅速，要求条件低（大肠杆菌倍增时间为17分钟），易于大规模培养。 （二）缺点 1、不能识别剪切内含子，不能表达基因组DNA，只能表达cDNA； 2、缺乏真核生物的蛋白质加工修饰系统，不能进行蛋白酶解、糖基化、磷酸化、乙酰化、硫酸化、酰胺化等修饰作用； 蛋白酶解作用：从蛋白前体中切去一段氨基酸序列，从而获得功能性分子 糖基化意义： 赋予蛋白独特的结合性并增强稳定性 3、不具备真核生物的蛋白质复性系统（如蛋白二硫键异构酶），不能进行真核蛋白的正确折叠； 二、酵母（yeast）表达体系特点 酵母菌是最简单的真核单细胞生物； 是外源真核基因最理想的表达体系。 （一）优点： 1、全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便2、具有原核生物无法比拟的蛋白翻译后加工修饰系统。对表达的蛋白可进行正确折叠和糖基化、磷酸化等修饰； 3、安全：不含特异病毒、不产生毒素，美国FDA认定为安全的4、繁殖迅速（倍增期约2小时 ），要求条件低，大规模发酵工艺简单，成本低廉； 5、能外分泌 （二）缺点： 1、生长相对细菌缓慢 2、对有些生物活性蛋白仍无法表达或正确修饰，比如蛋白超糖基化 超糖基化修饰作用 酵母菌糖蛋白的N－糖基外链的组成成分只有甘露糖，但其分支结构极为复杂的的现象称为超糖基化修饰作用。 酵母菌 高等真核生物 O－寡聚多糖链 甘露糖单体 唾液酸基团 N－糖基外侧链 甘露糖 甘露糖 N－乙酰葡萄糖胺 半乳糖 果糖 唾液酸等 N-连接糖基化(N-linked glycosylation) 新合成蛋白进行糖基化修饰的一种方式。 糖通过与蛋白质的天冬氨酸的自由NH2基连接，所以将这种糖基化称为N-连接的糖基化。 O-连接的糖基化（O-linked glycosylation） 高尔基体中进行的另一种蛋白质的糖基化，将糖链转移到多肽链的丝氨酸、苏氨酸或羟赖氨酸的羟基的氧原子上。 三、哺乳动物细胞表达特点 缺点： 1、细胞生长慢，培养条件刻苛，大规模培养工艺复杂、费用高 2、培养液中产物浓度较小 3、转化细胞筛选麻烦 主要基因工程表达体系比较 一、大肠杆菌表达体系 （一）生物学特性 革兰氏阴性杆菌 大小2～4um×0.4～0.1um； 无芽孢； 一般无荚膜(capsule) 裂殖(Fission)分裂，37℃17分钟繁殖一代。 （二）特点 优点： 1、载体受体系统完备 2、外源基因表达水平高，可达总蛋白5％～30％； 3、下游技术成熟 缺点： 1、 胞内表达蛋白易形成无活性的包涵体，需进行复性操作；可溶性表达的胞内真核蛋白易被细菌蛋白酶水解 2、蛋白分泌机制不健全，外源真核基因很难实现分泌表达，且分泌产物大多只能分泌到细胞周质（细胞质与外膜之见的间隙）；少数分泌表达的蛋白表达效率比包含体形式低很多。 3、胞内表达产物蛋白质N端多余一个甲硫氨酸残基（由起始密码ATG编码），影响活性或容易引起免疫反应 4、 细胞壁含脂多糖（内毒素），增加了分离纯化难度 包