李立军SEP162002.pptVIP

* * LC-MS/MS定量分析一般步骤 李立军OCT 2003 准备工作查阅文献做好样品前处理，萃取 浓缩 分离 纯化.有条件的可先在HPLC上摸好LC条件，能够基本分离更好，缓冲体系符合MS要求.溶剂包括水的纯度，最好色谱纯以上。新的色谱柱可能要先冲洗很长时间才能干净,某些样品非常容易吸附在进样阀和管路中，用溶剂清洗。质谱仪须校准，预热时间要足够长，气流的稳定也很重要，液N气阀开度要注意，达到稳定程度。 MS条件优化先定性后定量首先,确定离子化方式： ESI or APCI，POS or NEG用10-100ppm的纯样，Q1 SCAN 察看存在哪些离子,要能够看到待测的母离子，应明显比周围的噪声离子高，通过改变DP,观察离子的增减,若为POS方式，看M+1，M+18，M+23等等,初步判断分子离子,如看不到则可能是浓度太低或离子化方式不合适，或选择的溶剂体系不合适。  母离子选M+H,或M-H最好,但有时只有M+NH4,M+Na等,这样CAD能量可能需要高些,选择[M+H]+，还是+NH4，Na等，要由化合物决定，加合离子-若稳定，则可用，不稳定则可能需换流动相，但+H通常好些，所需碰撞能量低，灵敏度高。如含Cl可选择2个母离子峰。 SIM与MRM，单级Q只能SIM，MRM可看成2个SIM，选择性更好，。 再根据上一步确定的较纯的母离子进行PRODUCT SCAN,确保所有碎片离子都来自待测化合物，而不是溶液中的杂质，找出较强的碎片离子信息,还可改变CE，从中选定MRM需要测定的一对或更多离子对,为最后LC-MS/MS联用做准备. 做PRODUCT SCAN时,注意小数点后的位数,MRM输入要准,灵敏度才高。先多选几个离子对，待出现基质干扰时可换，最后根据法规要求确定离子对数目。 MRM方式优化仪器,通过优化仪器参数,使得母子离子都达到一定强度平衡,使MRM灵敏度最高.可先让仪器自动优化参数，然后再手动细致优化，只检测一对离子时根据TIC的强度来确定仪器参数，一次优化多对离子时，要根据每对离子的XIC强度来分别确定仪器参数。  先用注射泵优化COMPOUND项下面的参数,如DP,CE及CAD等,再接通LC用FIA优化其他参数如温度，气流和IS电压及离子源位置, 或接一个三通,样品仍由注射泵进入离子源,同时LC保持需要的流量. 然后进行MRM测定。 CURTAIN GAS在不降低灵敏度情况下尽量大些，温度在达到灵敏度时不用太高，气流也不用太大，这样可以提高信噪比，保持信号稳定。 分辨率的选择：当样品较纯，Q3可选LOW，提高灵敏度，若选LOW后本底噪声太高则意义不大。 LC条件优化：色谱柱长度可根据分离的要求而定，定性可长些,定量在能有效排除干扰情况下尽量短,提高效率；内径最好选细径柱如2mm的,1mm的,IS可不分流, 4.6mm柱用1ml流量时如不分流灵敏度还不是最佳,不如流量低时更好。流速高，峰形好。不同牌号色谱柱，效果很可能不同。 PH的影响-正离子方式PH要低些,负离子方式PH要高些,除对离子化有影响外,还影响LC的峰形,以至定量误差。流动相加乙酸铵可适合大部分测定要求。 LC-MS/MS与LC-UV比较:通常LC-MS/MS 因选择性好，灵敏度高，定量更准确，但质量范围很宽全扫描时不一定灵敏度高。LC梯度的设定,目的是快速分离,峰形好,缩短时间,提高效率,选短柱亦是如此.溶解稀释被测物最好用流动相,或尽量接近的体系，否则可能峰形不好,变宽,出怪峰等使定量不准. 用流动相配的标样，初步优化确定LC条件是否合适, 标准品工作液现配现做，尤其是较低浓度，时间长了可能因吸附分解等降低。进样顺序要先稀后浓。洗针液要常换，进过浓样后要进一针空白，检验是否有残留污染。顺序：纯样-添加样-实际样品。流动相液优化后，空白提取液配制标准再优化，看干扰，空白添加再提取后看回收率。用空白提取液配制标准样做曲线，准确，有效排除干扰因素。 前处理方法的优化LC，MS都优化还不行，改提取方法。离子抑制-改变前处理方法或LC条件。内标用法，药代动力学时多采用内标，选择原则：内标物与被测物的化学性质有区别时,要注意干扰基质对他们的离子化影响的不同，尽量选同系物。还可利用同位素标记。衍生化-稳定，信号强，例如硝基呋喃类，衍生化后容易测量。 * *