基因工程32大肠杆菌克隆载体.ppt

第三章第二部分 大肠杆菌的克隆载体 Cloning Vectors for E. coli 所有克隆质粒中，最多的一类是以大肠杆菌为宿主的。 因为： 过去50年内，这种细菌在基础研究中一直扮演着中心角色； 已积累大量有关大肠杆菌的微生物学、生物化学和遗传学知识； 事实上所有关于基因结构和功能的基础研究都是以大肠杆菌为材料而开展的。 3.1 基于大肠杆菌质粒的克隆载体 基因克隆领域最得到广泛应用的也是最简单的，是那些以大肠杆菌质粒为基础而构建的克隆载体。 可用于大肠杆菌的有很多不同的质粒载体，其中有很大一部分是由商业公司提供的。他们开发的载体既易于纯化，又结合一些想要的特性，如高的转化效率、方便的转化和重组的筛选标志以及克隆相当大的DNA片段(高达8kb)的能力。 如：pBR322。pBR322是最早被构建的质粒，至今仍被广泛使用。 3.1.1 质粒克隆载体的命名法 “pBR322”这个名字符合载体命名法的标准规则： “p”说明它是一个质粒； “BR表示最初构建它的实验室(BR代表了两个构建人的名字：Bolivar和Rodriguez)。 “322把该质粒和该实验室构建的其他质粒区分开来(另外还有pBR325，pBR327，pBR328 3.1.2 pBR322的一些有用特性 从pBR322的遗传图谱和物理图谱(图6-1)可以看出为什么它能是一个如此受欢迎的克隆载体？ 第一个优点在于它的大小 第2章里提到，作为一个克隆载体它的大小应该小于10kb，否则在提纯它的时候很容易导致DNA断裂。 pBR322只有4 363bp，意味着可以很容易纯化质粒本身及其所携带的重组DNA分子。即使添加上6kb的DNA链，重组的pBR322的大小仍在可操作的范围内。 第二个优点是拥有两套抗生素耐药性基因 两个耐药性基因(氨苄青霉素耐药性和四环素耐药性基因)都可作为含有该质粒的筛选标志，而且每个抗性基因内都拥有一个限制性单酶切位点，这在克隆实验中非常有用。 用PstI，PuvI或ScaI酶切后插入DNA会导致氨苄青霉素抗性基因失活；用BamHI及HindⅢ等8个限制性内切核酸酶酶切后插入DNA会导致四环素抗性基因失活。 这意味着pBR322支持很多种不同黏性末端的DNA片段的导入。 第三个优点在于pBR322有相当高的拷贝数 通常在被转化过的大肠杆菌中有大约15个pBR322质粒分子； 在蛋白质合成抑制剂(如氯霉素)的存在下，通过质粒扩增，拷贝数可以增加到1 000-3 000。 这样，通过培养大肠杆菌就可以获得大量重组过的pBR322质粒分子。 3.1.3 pBR322的家谱 pBR322作为一个克隆载体的方便性决非偶然，它在被设计时就定好了要拥有这些特点。 构建pBR322的步骤简述如图。 它的构建是一件曲折而艰巨的操作，用到了全部巧妙的基因操作技术。 pBR322实际上由3个在自然界存在的天然质粒拼接而成。 3.1.4 其他大肠杆菌质粒克隆载体 pBR322质粒是在20世纪70年代后期被构建出来的，第一份描述它的用途的论文在1977发表。 从那以后，人们构建了大量其他的质粒克隆载体，它们大多数只是对pBR322作了少量修改。 pBR327—一个高拷贝数质粒 pBR327通过从pBR322中移除一个长1 089bp的片段而构建。片段的删除并没有损伤ampR和terR这两个抗性基因，但改变了质粒的复制能力和接合能力。 pBR327与pBR322有两点重要的不同 (1)pBR327的拷贝数比pBR322更高。 每个大肠杆菌中可以存在30-45个质粒分子。 当实验的目标是研究被克隆的基因功能的时候，有更高拷贝数的pBR327就更适合于用作载体。 拷贝数越高，被克隆的基因在细胞中所产生的效果就越容易被发现。 (2)1 089bp片段的删除，破坏了pBR322的接合能力，使pBR327不能把自己转移到另外一个大肠杆菌细胞中去。 这一点对生物防范很重要，避免了粗心的生物学家使重组后的质粒从试管和细菌植株中逸出。 相反，pBR322在理论上可以通过结合而进入天然的大肠杆菌细胞中去，虽然事实上pBR322也有一定的安全措施减少这种情况的发生。 当被克隆的基因有潜在的危害性时，应优先选择pBR327。 pUC8—乳糖选择质粒 pUC8也是一个源自于pBR322的质粒， 只保留了pBR322的复制起点和ampR基因。 ampR基因的核酸序列也被改变了，不再包含唯一的限制性酶切位点。 所有这些位点被集中到pUC8所携带的lacZ基因中的一小段序列上。 pUC8所拥有的3个优点使它成为最受欢迎的大肠杆菌克隆载体之一。 第一个优点 人们在构建这个质粒时，在它的复制起点上产生了一个偶然的突变