柱穗山羊草α—醇溶蛋白基因的克隆与序列分析.docVIP

柱穗山羊草α—醇溶蛋白基因的克隆与序列分析 　　摘 要：根据已知的普通小麦α-醇溶蛋白基因序列设计引物，采用PCR方法克隆基因并进行序列分析。从柱穗山羊草Y127中克隆得到1个α-醇溶蛋白基因序列Gli2-Z-2，它具有α-醇溶蛋白基因的典型结构特征，编码区全长939 bp，编码313个氨基酸。氨基酸序列比较显示，Gli2-Z-2在多聚谷氨酰胺区比已报道的α-醇溶蛋白序列有较多的谷氨酰胺残基。 　　关键词：柱穗山羊草；α-醇溶蛋白基因；基因克隆；序列分析 　　中图分类号：Q785 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2012）10-0007-04 　　小麦籽粒的加工品质受多种因素影响， 其中籽粒贮藏蛋白的组成和含量起重要作用[1]。小麦籽粒贮藏蛋白的主要组成成分是麦醇溶蛋白和麦谷蛋白， 其中醇溶蛋白是胚乳中产生的小麦种子储藏蛋白的主要类型，与面团特性高度相关[2，3]，在组成上以单体形式存在，具有高度的异质性和复杂性[4]，富含脯氨酸和谷氨酰胺，对面团物理特性有重要作用[5]。根据在SDS上的迁移率可将醇溶蛋白分为α、β、γ 和ω 4 类，除ω-醇溶蛋白没有半胱氨酸（Cys）不能形成二硫键外，其余均能形成分子内二硫键。α-麦醇溶蛋白多肽富含硫，分子量约为30～45 ku，由第6 部分同源染色体短臂上的Gli-2位点编码，而其余小麦醇溶蛋白基因位于第1部分同源染色体短臂上[6]。在4种醇溶蛋白类群中，α-醇溶蛋白含量最丰富，占小麦种子储藏蛋白的15%～30%，是人类消费量最大的蛋白质。 　　柱穗山羊草（Ae.cylindrica Host，CCDD， 2n=x=14） ， 属于禾本科（Poaceae） 小麦族（Triticeae Dumort） 山羊草属（Ae. gilops L.） 柱穗山羊草组（Cylindropyrum），分布在法国南部、意大利、南斯拉夫、匈牙利、罗马尼亚、保加利亚、阿尔巴尼亚、希腊、俄罗斯南部、阿富汗、伊朗、伊拉克北部、土耳其和叙利亚。由粗山羊草与尾状山羊草天然杂交进化而来， 由于长期的自然进化， 蕴涵大量遗传资源， 是小麦育种材料的补充[7]。由于α-醇溶蛋白基因的克隆在柱穗山羊草中报道较少，本研究旨在从柱穗山羊草中分离α-醇溶蛋白基因，并对其进行序列分析，研究α-醇溶蛋白在小麦及其近缘属种中的进化关系。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　供试材料为柱穗山羊草Y127，由中国国家种质库提供。 　　1.2 方法 　　1.2.1 DNA提取 植物总DNA的提取采用CTAB法[8]。 　　1.2.2 PCR 引物设计和基因组DNA扩增 根据已报道的α-醇溶蛋白基因序列，设计了一对可扩增α-醇溶蛋白基因完整编码区的引物：正向引物PF（5′-ATGAAGACCTTTCTCATCCTTG-3′）和反向引物PR（5′-TCAGTTA/GGTACCG/AAAGATGCC-3′，“/”表示简并），分别位于醇溶蛋白基因编码区的起始端和终止端。PCR 反应总体积为50 μl，其中含10×buffer 5 μl、1.5 mmol/L MgCl2、4种dNTP各200 μmol/L、引物各150 ng、Taq plus DNA polymerase（高保真）1.5 U、基因组DNA 100 ng。PCR反应程序为：94℃预变性4 min；然后94℃变性45 s，63.8℃退火1 min，72℃延伸45 s，共30个循环；最后72℃延伸5 min。 　　1.2.3 PCR产物回收纯化、T-载体克隆与阳性克隆筛选 PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上检测，将目的片段回收纯化后连接到pEASY-T1载体上，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。对白色菌落进行PCR扩增，确认阳性克隆。 　　1.2.4 序列测定与比较分析 DNA测序由华大基因公司完成，序列分析利用NCBI 网站和DNAman进行。 　　2 结果与分析 　　2.1 PCR 扩增、目的片段回收与克隆 　　用引物PF、PR对Y127基因组总DNA进行PCR扩增，在1%琼脂糖凝胶上分离，检测出一条900 bp左右的带。将目的片段回收纯化后，连接到pEASY-T1载体上。对白斑进行PCR扩增，确认为阳性克隆后进行测序，得到1个新的基因序列，命名为Gli2-Z-2（图1）。 　　2.2 Gli2-Z-2核苷酸序列分析 　　将从Y127中克隆得到的醇溶蛋白基因序列Gli2-Z-2在NCBI网站上进行核苷酸序列检索，结果发现与已知醇溶蛋白基因序列存在较高的相似性，相似度在80%左右。Gli2-Z-2的完整编码区全长为939 bp，可翻译成含313个氨基酸残基的蛋白质。 　　2.3 Gli2-Z-2氨基酸序列分析 　　对于Gli2-Z-