质粒DNA的提、定量、酶切与PCR鉴定实验报告.doc

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定 一、实验目的 实验原理1.PCR(多聚酶链式反应) 在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。 PCR一次循环的具体反应步骤为： A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链 。 B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。 C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。 2.质粒DNA的提取与制备 (1).碱裂解法： 染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异： A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性； B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。 (2).离心层析柱： A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质； B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除； C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）： A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性； B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱: DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰 蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰 碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰 C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度； A260/A280=1.8 DNA纯净 A260/A2801.8 表示蛋白（芳香族）或酚类物质材料与方法一实验材料2×Premix Taq、引物ＤＮＡ10×M酶切缓冲液Buf R、质粒DNA、Hind III (15U/ul)、EcoR I(12U/ul) Gelview、TBE、DNA Marker 5000、电泳缓冲液 2. 质粒DNA的提取与制备 3. 质粒DNA的定量（紫外分光光度法） 4.质粒DNA的酶切鉴定 5.琼脂糖凝胶电泳 四、结果与讨论 loan management (post) review: 1, approval criteria have been implemented; 2, the contract is correct; 3, in line with the contract, payment; 4, no other major cases against loan security;、Reviewed by: date of record form 9: qilu bank borrowing by single years of maximum amount a maximum no-loan borrowers: borrowers: ... Borrower name number, line of credit expiry date year month day to year month day maximum number of years in the loan contract are the top line opened, the borrowed and requested your bank opened credit lines above, is hereby requested. Borrower signature: date agreed to open credit lines. Customer Manager signature: date agreed to open credit lines. Loan review signature: date line cancellation-I did not use the loan amount, your bank credit lines to be cancelled. -Credit loan principal repayment, your bank credit lines to be cancelled. Borrower signature: date-unuse