绿色植物中色素提取和分离.doc

绿色植物中色素的提取和分离 [实验名称] 绿色植物色素的提取及色谱分离 [教学目标] 知识与技能: 通过对绿色植物色素的提取与分离，了解天然产物分离提纯的方法 [教学重点] 学习柱色谱和薄层色谱分离的基本原理及操作方法 [教学难点] 薄层色谱、柱层析实验操作要点的掌握和应用 [教学方法] 陈述法，讲演法 [教学过程] [讲述] 【实验目的】 1. 通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法； 2. 通过对柱色谱和薄层色谱操作方法的掌握，加深了解微量有机物色谱分离、鉴定的原理。 [讲述] 【背景知识】 绿色植物的叶、茎中，如菠菜叶，含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg)，其差别仅是叶绿素a中一个甲基被甲酰基所取代从而形成了叶绿素b。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素a的含量通常是b的3 倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。胡萝卜素（C40H56）是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体，即a-胡萝卜素、β-胡萝卜素和γ-胡萝卜素，其中β-胡萝卜素含量最多，也最重要。叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。 本实验先根据各种植物色素的溶解度情况将胡萝卜素（橙）、叶黄素（黄）、叶绿素a和叶绿素b从菠菜叶中提取出来，然后根据各化合物物理性质的不同用色谱法进行分离和鉴定。 [图示] 【分离产物结构式】 叶绿素a、叶绿素b、叶黄素（黄）和β-胡萝卜素的结构式如下图所示： [讲述] 【色谱法原理】 色谱法是分离、提纯和鉴定有机化合物的重要方法。其分离原理是利用混合物中各个成分的物理化学性质的差别，当选择某一个条件使各个成分流过支持剂或吸附剂时，各成分可由于其物理性质的不同而得到分离。与经典的分离提纯手段（重结晶，升华，萃取和蒸馏等）相比，色谱法具有微量、快速、简便和高效等优点。按其操作不同，色谱可分为薄层色谱、柱色谱、纸色谱、气相色谱和高压液相色谱等。在此，我们学习柱色谱和薄层色谱（TLC）。 1. 柱色谱原理 液体样品从柱顶加入，流经吸附柱时，即被吸附在柱中固定相（吸附剂）的上端，然后从柱顶加入流动相（洗脱剂）淋洗，由于固定相对各组分吸附能力不同，以不同速度沿柱下移，吸附能力弱的组分随洗脱剂首先流出，吸附能力强的组分后流出，分段接收，以此达到分离、提纯的目的。 2. 薄层色谱原理 由于混合物中的各个组分对吸附剂（固定相）的吸附能力不同，当展开剂（流动相）流经吸附剂时，发生无数次吸附和解吸过程，吸附力弱的组分随流动相迅速向前移动，吸附力强的组分滞留在后，由于各组分具有不同的移动速率，最终得以在固定相薄层上分离。其应用主要有：跟踪反应进程；鉴定少量有机混合物的组成；分离；寻找柱色谱的最佳分离条件等。 [提问] 试比较叶绿素、叶黄素和胡萝卜素三种色素的极性，为什么胡萝卜素在层析柱中移动最快？ [讲述] 【实验试剂】 新鲜菠菜3g、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、硅胶G、中性氧化铝 [讲述和演示] 【实验步骤】 1. 菠菜色素的提取过程 取3g 新鲜菠菜叶于研钵中拌匀研磨5 分钟，残渣用20mL 的石油醚-乙醇（2:1）混合液进行提取，共提取两次。把浸取液合并过滤，滤液转移到分液漏斗中，加入等体积的水洗涤后弃去下层的水-乙醇层，石油醚层再用等体积的水洗涤两次，以除去乙醇和其它水溶性物质。石油醚层用无水Na2SO4进行干燥、浓缩为2 mL。取一半做柱层析分离，其余留作薄层层析分析。 2. 柱色谱的一般过程及菠菜色素的分离： 【柱色谱的一般过程】 （1）选择吸附剂： 常用的吸附剂：氧化铝，硅胶，氧化镁，碳酸钙，活性炭等 选择规则：吸附剂必须与被吸附物质和展开剂无化学作用；吸附剂的颗粒大小要适中；可以根据被提纯物质的酸、碱性选择合适的吸附剂。 化合物的吸附能力与分子极性的关系：分子极性越强（或分子中所含极性较大的基团）其吸附能力也较强。极性基团的吸附能力排序如下： （2）选洗脱剂： 根据被分离物各组分的极性和溶解度选择相应极性的溶剂，当单一溶剂无法很好洗脱时，可考虑选择混合溶剂。 溶剂的洗脱能力按递增次序排列如下：己烷（石油醚）、四氯化碳、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、丙醇、乙醇、甲醇、水。 （3）装柱：色谱柱的大小应视处理量而定，柱长与直径之比，一般为10:1 ~ 20:1。固定相用量与分离物质用量比约为50:1 ~ 100:1。 装柱的方法分湿法