基于分子生物学的长口外海域中微生物鉴定.doc

基于分子生物学的长江口外海域水中微生物鉴定 第 PAGE 2页共 NUMPAGES 17页 基于分子生物学的长江口外海域中微生物鉴定 摘要：作为国家卫星海洋中心组成部分，本论文主要是初步查明秋季长江口外海域海洋悬浮物中的微生物种类。2008年秋季，我们在长江口外海域采集的海洋悬浮物样品，利用对海洋微生物16SrRNA基因的直接扩增，克隆和测序，从而鉴定微生物的种类。通过开展本研究，我们希望能初步查明长江口外海域海洋悬浮物中的微生物种类，为建立海洋微生物分子生物学检测的技术体系打下一定的基础。 关键词： 海洋微生物，种类鉴定，16SrRNA，海洋悬浮物 Identifications of Microorganism from the Outside waters of Changjiang Abstract: Being as a major part of Satellite Ocean Center of China , this study is trying to primarily investigate the microorganism species in the Suspended solids from the Outside waters of Changjiang River Estuary。 In fall in 2008, we collected Suspended solids samples from the biology investigation spot 24 of Satellite Ocean Center of China, then identified the marine microorganism species by using direct amplifications of 16S rRNA gene from marine microorganism, cloning and sequencing techniques. In this study, we hope to identify the marine organism species in sediment from the China East Sea near to Shanghai, which could provide basis for the establishments of marine microorganism molecular detection technique system. Key words: Marine microorganism, species identification, 16SrRNA, marine sediments 基于分子生物学的长江口外海域中微生物鉴定 DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。 电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。 离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温. 三、 琼脂糖凝胶的制备 1、 取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用。 2、 胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。 3、 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽