红豆杉体外培养生产紫杉醇方案.ppt

红豆杉体外培养生产紫杉醇技术介绍 酶工程 李爽 15S128041 卵巢癌 智利最高21/10万人，日本最低3.2/10万人。 在我国，也是最常见的妇科肿瘤疾病10%，诊断时70%为恶性晚期，5年生存率仅30%～40%。 发病率近40年上升3倍。 紫杉醇（Taxol） 从红豆杉中分离出的二萜类化合物。是一种微管聚合促进剂。 紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。 红豆杉 红豆杉科红豆杉属，全世界共11种。 西藏红豆杉，东北红豆杉，云南红豆杉等。 二级濒危植物 紫杉醇（Taxol） 1个卵巢癌患者=6棵树龄60～100年的红豆杉 200kg/年紫杉醇=1000000棵红豆杉 紫杉醇（Taxol）生产 1从红豆杉非树皮部位提取 2大量种植筛选的优良品种 3化学合成：半合成，全合成 4寻找紫杉醇类似物：Taxotere 5生物技术：细胞培养，基因工程，微生物生产 红豆杉愈伤组织诱导 一外植体的选择 根、茎、叶、树皮、形成层、大配子体、种子胚、假种皮、幼苗胚轴、芽等。 培养基： MS培养基：幼叶诱导率最高 B5培养基：幼茎诱导率最高 树种：云南红豆杉中国红豆杉东北红豆杉 取样时间：早春夏季秋季 云南红豆杉，中国红豆杉愈伤组织紫杉醇含量较高。 红豆杉愈伤组织培养 二培养基 诱导培养基：MS 增殖培养基：B5 成分：NO3-利于愈伤组织生长，NH4+利于紫杉醇积累 有机物：10%椰子汁（CM）或0.1%水解酪蛋白（CA） 激素：2.0mg/lNAA诱导效果更好，0.4mg/lNAA更宜于愈伤组织生长 B5培养基+2.0mg/lNAA+1.0mg/lIAA+0.5mg/lLKT=100%诱导率 红豆杉愈伤组织培养 三培养基优化 氮源：AgNO3 碳源：蔗糖（10,16,22g/L） 前体物：氨基酸前体复合物 诱导子：柠檬酸三铵（154mg/L,1540mg/L） 最优组合：0d+1.67mg/L AgNO3,9d+10g/L蔗糖+1540mg/L柠檬酸三铵 紫杉醇含量最高，39.2mg/L2.1mg/L 18.7倍 红豆杉愈伤组织培养 四培养条件 诱导与培养的适宜温度为20～25℃ 黑暗条件光照条件（3倍） 红豆杉细胞培养 1细胞悬浮培养 300mg/L 2两步法培养 153mg/L 3固定化培养 4.9mg/L 4两相法培养 17倍 红豆杉细胞悬浮培养 植物细胞悬浮培养 植物细胞或小的细胞聚集体在液体培养基中，于摇床上进行悬浮培养。 与传统的整株材料相比,植物细胞悬浮体系具有分散性好、细胞形状及细胞团大小大致相同,而且生长迅速、重复性好、易于控制等优点。 红豆杉细胞悬浮培养 Bestoso F等欧洲榛的茎，树叶和胚作为外植体 第一步培养： MS培养基+3.0mg/LNAA+0.5mg/L激动素+100mg/L精氨酸+2.5%蔗糖+0.8%琼脂 培养2个月，对胚形成愈伤组织的诱导率可86.4%，枝条的诱导率100% 。 一段时间后转移到B5培养基上后，可加快愈伤组织的生长。 红豆杉细胞悬浮培养 第二步培养： 愈伤组织处理为细胞团后，转移到培养基中悬浮培养。 B5+硫酸氧钒+硝酸银+氯化钴盐 使细胞获得最大生长速率。 10d后+1%蔗糖+50mg/L柠檬酸钠。 20d+0.1mM苯丙氨酸。 25d+诱导剂 可显著提高紫杉醇的产率。 红豆杉内生菌产紫杉醇 内生真菌：生活在健康植物体内，但不引起任何病害性状的真菌。 菌种分离：从外植体上长出的菌丝中，挑取不同菌落的菌丝尖端接种到PDA培养基中培养，多次纯化后可得纯株。 目前已分离的内生真菌种类不同，产物多样，包括紫杉醇，紫杉酚，芳香族氨基酸脱羧酶等。其中紫杉醇产率0.024～185.4ug/L，发酵产量很低。生物改造的真菌紫杉醇产率也仅有448.52ug/L，远未达到工业化水平。 紫杉醇分离与提纯 有机溶剂-超声波提取法 高效液相色谱法（HPLC法）分离紫杉醇 溶剂种类粉碎粒度提取时间料液比 最优方案：原料95℃烘干至恒重，粉碎100目，95%甲醇，60℃提取20h，料液比1:10 得率：0.086mg/g Reference