SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳课件.pptVIP

聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种因素：蛋白大小，形状和电荷。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）。 1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小。 SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与SDS分子结合时，可形成SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。 SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，使蛋白复合物分解成多个亚基。 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质（亚基）分子大小。 使聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应。 按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连续系统和不连续系统两大类： 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应分离。 不连续系统中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度以及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种用抗原抗体的特异性结合来检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。 将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的小烧杯； 把玻璃板在灌胶支架上固定好，放好密封条和隔离板, 固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板; 按照下表配制12％分离胶与4％浓缩胶； 样品的制备：样品和标准蛋白分别与5倍上样缓冲液按5：1的比例混匀，并在100度沸水浴中煮5min，取出待用； 按比例配好分离胶,用移液管快速加入，大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水（或异丙醇除泡），静置至胶凝固； 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注胶过程 最好一次性完成，避免产生气泡； 水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡； 胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面； 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，连续平稳加入缩胶至离边缘5mm处，迅速插入梳子，静置到胶凝固。 梳子需一次平稳插入，梳口处不得有气泡,梳底需水平。 拔出样梳后,拆掉密封条，在内槽中加入缓冲液； 上样： marker 5 μl 样品20 μl + 5×上样buffer 5μl 共25μl 上样时要记清上样的顺序 微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高, 样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔 接通电源，100V恒压电泳，至溴酚蓝距凝胶边缘约0.5～1cm时，约2.5h，停止电泳； 凝胶的处理： 剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，剥胶时要小心,保持分离胶完好无损,将分离胶做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染色液，染色约4h；染色后的凝胶板用脱色液脱色0.5h，直到蛋白质区带清晰。 蛋白质印迹操作 免疫检测的操作 将膜用100％甲醇浸湿5min，再用超纯水漂洗一下，移至含有50ml封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h； 将一抗（大鼠抗人NGAL单克隆抗体）用封闭液1：200稀释；铺保鲜膜于实验台面，将抗体溶液（每张膜500μl液体）加到保鲜膜上； 从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，室温下孵育2h； 用PBST在室温下脱色摇床上漂洗两次，每次5min，再用PBS漂洗一次，5min； 二抗（山羊抗大鼠IgG HRP）用封闭液1：2000稀释并与膜蛋白面接触（每张膜500μl液体），室温下孵育2h； 用PBST在室温下脱色摇床上漂洗两次，每次5min，再用PBS漂洗一次，5min，进行化学发光反应。 NGAL（neutrophil gelatinase-associated lipocalin）即中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，是脂质运载蛋白（lipocalin) 家族的一个成员。 NGAL基因的蛋白产物具有保护调节基质金属蛋白酶-9的活性，作为小分子铁配合物结合蛋白参与机体铁代谢和天然免疫反应等功能。另外，NGAL作为一种早期标志物还可以帮助判定缺血性肾损伤程度。 NGAL的mRNA信息在NCBI核酸数据库中有来自不同实验室登记的多个版本，包含完整编码区的有BC033089和NM_005564等，编码区长为597 bp，编码198个氨基酸，包含了N端前部长为20个氨基酸的信号肽序列（为核酸序列的1-60 bp）。 NGAL基因的简介 NGAL核酸编码区