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(一)实时定量测定细胞内Ca2+的变化 (二)测定细胞内PH变化 (三) 检测膜电位的变化 (四)检测细胞内活性氧物种的产生 (五)检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位 (六)检测荧光共振能量转移(FRET) (七)检测荧光漂白恢复(FRAP) KCL诱导的细胞外Ca++内流测量 培养/分离的细胞 ? 20?M Fluo 3-AM负载液30-60min ? 清洗、换液 ? 扫描 KCL 若须快速测量 1.改变扫描速度 2.采用双向扫描 3.减少采样点数(牺牲空间分辨率） 4.采用线扫描(xt) KCL 常用的荧光探针有BCECF和6-COFDA BCECF的激发光谱是PH依赖性的。在适当的pH值情况下可以被激发形成绿色荧光。 最大激发波长和发射波长因pH的不同而有所不同，最大激发波长大致在503nm左右，最大发射波长大致在520nm左右，实际检测时推荐使用的激发波长为488nm，发射波长为535nm。BCECF在不同pH条件下的发射光谱参考下图。 快响应探针: 膜电位直接影响探针分子的电分布而改变其光谱,响应快 慢响应探针: 主要通过改变其在膜内外的分布来对膜电位的变化作出反应.跨膜运动需要一定的时间,所以反应慢. 依探针对电位变化响应速度,将电位敏感探针分为快响应探针和慢响应探针 基本原理: a DCFH-DA进入细胞后 b 经酯酶作用脱去二酯,生成不发荧光的DCFH c 被超氧阴离子,过氧化氢等活性氧化生成发荧光的DCF d 活性氧自由基的含量与荧光探针之荧光强度成正相关 DCFH-DA常用于直接测定细胞内活性氧自由基的动态变化 DCFH-DA常用于直接测定细胞内活性氧自由基的动态变化 为检测药物分子,病毒,细菌等外界物质能否跨膜进入细胞/组织,需利用这些物质特异性自发荧光/对其进行荧光标记. 由于荧光蛋白的独特优点,其特定的荧光对理论上可用于活细胞中实时研究大分子间的相互作用. 荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体 Donor）的发射光谱与另一个基团（受体 Acceptor）的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时（一般小于100A0），就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光, 同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。 荧光能量共振转移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer) I.荧光能量共振转移: 受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫供体荧光素，能量的接受者叫受体荧光素。 供体荧光素 受体荧光素 1.供体与受体间的距离 10nm或=1-7nm 2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱有实质性的重叠 II.荧光能量共振转移的条件 488nm 520nm 650nm 540nm 650nm 488nm 520nm 供体荧光素 (Cy2) 受体荧光素 (Cy3) 供体荧光素 (Cy2) 受体荧光素 (Cy3) FRAP:是将待测细胞用荧光物质标记,借助高强度脉冲式激光照射细胞的某一区域,从而造成该区域荧光分子的光淬灭;通过低强度激光扫描成像,可以探测到该区域周围的非淬灭荧光分子向受照射区域扩散的速率. 从理论上讲,凡是能够标记待测分子,并且能够发生荧光淬灭的荧光物质都可以使用. Intensity Before bleach After bleach 90 min after bleach 荧光漂白恢复 (Fluorescence Recover after photobleaching; FRAP) 检测细胞连接间的信息传递 Laser Scanning Confocal Microscope 普通荧光显微镜的不足 使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅图像与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光，大大提高了分辩率（δ=0.61 λ/ NA ）。但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构）。 一、激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理 2. 共聚焦扫描