分子荧光和磷光分析法.ppt

第三章 分子发光分析法 一、 仪器与结构流程 instrument and general process 二、 荧光分析法和应用 fluorescence analysis and application 三、 磷光分析法的应用 phosphorescence analysis and application 一、仪器结构流程 仪器光路图 仪器框图 紫外-可见分光光度计测量池(吸收池) 同步扫描技术 可获得三维光谱图的仪器 磷光检测 二、荧光分析方法与应用 2.定量依据与方法 （2）定量方法 测定条件的选择 3.荧光分析法的应用 三、磷光分析法的应用 内容选择 麦克劳林级数展开 * * 第二节 分子荧光与磷光分析法 molecular luminescenceanalysis molecular fluorescence and phosphorescence analysis 测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器； 光源：灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。 荧光(磷光)分光光度计: 光源 样品池 激发 单色器 检测器 数据处理 仪器控制 发射 单色器 该型仪器可进行荧光、磷光和发光分析； 荧光分光光度计 样品池 I0 It I0 It IF,p 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差(??)和固定能量差及可变波长三种； 同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率； 如图。 合适的??可减少光谱重叠； 酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射光谱严重重叠，但??<15nm的同步光谱只显示酪氨酸特征光谱； ??>60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图 2. 三维荧光光谱 I F ∝f (λex 、λem) 蒽的激发光谱 固定发射波长、扫描激发波长 I F ∝f (λex 、λem) 蒽的发射光谱 固定激发波长、扫描发射波长 蒽的三维等高线光谱图 蒽的三维等荧光强度光谱 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。 测量方法： （1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。 （2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。 室温测量时，不需要杜瓦瓶。 1. 特点 （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？ 检测下限：0.1～0.1?g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。 （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）试样量少 缺点：应用范围小。 (1)定量依据 荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率? ： If = ? Ia 由朗-比耳定律： Ia = I0(1-10-? l c ) If = ? I0(1-10-? l c ) = ? I0(1-e-2.3? l c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后：(麦可劳林级数展开) If = 2.3 ? I0 ? l c = Kc 标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；（荧光增强法，荧光降低法） 比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较； 导数法： 时间分辨法： 同步扫描法： 矩阵法： 1.激发光和荧光波长的选择 2.散射光的干扰及消除 3.试剂的纯度及操作过程杂质的引入 (1)无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 (2)生物与有机化合物的分析 见表 1.稠环芳烃分析 采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）；见表 2.农药、生物碱、植物