第四章基因工程概论资料.ppt

第四章 基因工程概论;第一节、基因工程的概念 ;二、基因工程的基本步骤 基因工程的基本内容是有目的地对遗传物质功能单位进行综合，创造有价值的生物分子或新的动物、植物或微生物品系。基因工程的基本步骤主要有包括： ①??? 目的基因的制取； ②??? 基因载体的选择与构建； ③??? 目的基因与载体DNA的拼接； ④??? 重组体分子导入受体细胞，筛选和无性繁殖(克隆) ⑤??? 外源基因的表达和产物的分离纯化。; ????????????????????????????????????????????????????????? ;第二节 载体-宿主系统 ;一、质粒载体 质粒是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。 质粒特点 ①是染色质外的双链共价闭合环形DNA，可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300 kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。 ②能自主复制，是能独立复制的复制子。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。 ③质粒对宿主生存并不是必需的。;质粒分类 按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类：严紧控制型质粒和松弛控制型质粒 严紧控制型质粒的复制常与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞中只有1个到十几个拷贝； 松弛控制型质粒，其复制宿主不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。;二、噬菌体载体 噬菌体是感染细菌的一类病毒，有的噬菌体基因组较大，如λ噬菌和T噬菌体等；有的则较小，如M13、f1、fd噬菌体等。用感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。 λ噬菌体由头和尾构成，其基因组是长约49kb的线性双链DNA分子，组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。λ噬菌体感染时，通过尾管将基因组DNA注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。DNA进入大肠杆菌后以其两端12bp的互补单链粘末端环化成环状双链，可以两种不同的方式繁殖：;①溶菌性方式：在营养充足，条件适合细菌繁殖时，利用宿主菌中的酶类和原料，λDNA上基因可按调控的顺序表达合成构成噬菌体头、尾和尾丝所需的各种蛋白质，λDNA经多次复制合成许多子代λDNA，于是装配成许多子代的λ噬菌体，最后裂菌，释放出许多新的λ噬菌体。 ②溶原性方式：进入细菌的λDNA可整合入细菌的染色质DNA中，随细菌染色体DNA复制，传给细菌后代，这个稳定潜伏在细菌染色质DNA中的λDNA称为原噬菌体，含有原噬菌体的细菌称为溶源菌。λDNA的整合是可逆的，原噬菌体可从宿主DNA中切出，进入溶菌性方式的繁殖。;λ噬菌体整个基因组，可分为三个部分， ①左臂：从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。 ②中段：长约20kb，是λDNA整合和切出，溶原生长所需的序列。 ③右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区域内。左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。 ;三、动物病毒载体 质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒SV40、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等;第三节 工具酶与基因工程 ;一、限制性核酸内切酶的概念 核酸酶可分为两类：核酸外切酶和核酸内切酶 核酸外切酶是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来； 核酸内切酶则从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸链切断。很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并将其分解，1962年发现这是因为细菌中含有特异的核酸内切酶,能识别特定的核酸序列而将核酸切断;同时又伴随有特定的核酸修饰酶,最常见的是甲基化酶,能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化,从而避免受内切酶水解,外来核酸没有这种特异的甲基化修饰,就会被细胞的核酸酶所水解.这样细胞就构成了限制一修饰体系,其功能就是保护自身的DNA,分解外来的DNA,以保护和维持自身遗传信息的稳定, 这就是限制性核酸内切酶名称中“限制”二字概念的由来。;二、限制性核酸内切酶的命名 按酶的来源的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为Hin