第四章基因克隆的载体资料.ppt

第二节 噬菌体载体 （Bacteriophage，简称phage） ;一、λ噬菌体载体;λ phage;The phage ? cos ends(cohesive-end site ); 通过Cos末端互补单链形成环状 DNA 分子，在宿主细胞的 DNA 连接酶和旋促酶作用下，形成封闭的环状 DNA 分子，充当转录的模板。 ;λ噬菌体的基因组结构;λ phage; Viruses that can infect bacteria. 48.5 kb in length Linear or circular genome (cos ends); 1. 插入式载体 一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的派生载体。 2. 替换型载体（取代型载体） 具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的λDNA区段可以 被外源插入的DNA片段所取代。 ; λ噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。 cI基因插入失活：如λ gt10、λNM1149等载体，在cI基因上有EcoR I及Hind III的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。 Lac Z基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位点，插入失活后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。 ; cI; Charon 16A;λ 替换型载体（取代型载体）; 野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的，外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。 spi-选择??λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就不能正常生长。 替换型噬菌体λ是使用最广泛的载体。 ;Lac;;;1. 应用适当的核酸内切酶消化λ载体，除去可取代的DNA片段； 2. 将上述所得的 λDNA载体臂同外源DNA片段的连接； 3. 对重组体的λDNA分子进行包装和增殖，以得到有感染性的λ重组噬菌体; λ噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达106～108/μgDNA，而以转染（translation）的方式导入的频率仅为103～105/ μgDNA。 λ噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA（约48.5 kb）的75%-105%。; 由于λ噬菌体包装时，当DNA的长度短于野生型的78%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。因此只包装它的野生型DNA（48.5KB）的75% ～ 105%左右的ＤＮＡ，要求λ载体DNA和外源DNA长度之和在39～53kb之间。 插入式载体可携带的外源DNA片段较替换式为小。 ;;（左右臂连接） （三段自身连接） （插入片段） ;根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选;二、单链DNA噬菌体载体(M13); M13是一种含单键（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链DNA片段，这种单链DNA片段在遗传学研究中主要用来测定DNA序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。 ;.感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型DNA（ replication form DNA, RF DNA）。可以象质粒DNA那样在体外进行纯化和操作。 ;2.成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞，这是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论是RFDNA或ssDNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。 ;M13 life cycle; 具有多克隆位点(MCS)，方便克隆。许多M13载体的多克隆位点与质粒载体pUC序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择上更为方便。 可以定向的克隆DNA片段，克隆在M