选1-5-1DNA的粗提取和鉴定概念.ppt

* 1.DNA提取和鉴定的原理 2.DNA粗提取的过程 考点：P54 专题5 DNA和蛋白质技术 课题1 DNA的粗提取与鉴定 一、基础知识： 1、提取生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学方法分离具有不同 物理或化学性质的生物大分子 2、提取DNA的基本思路 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分 一、基础知识： 3、DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当 的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀， 或者相反。 一、基础知识： ①根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？ DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图 在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。 一、基础知识： DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离 5、DNA在酒精溶液中的溶解性 一、基础知识： 6、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 ①蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响 ②大多数蛋白质不能忍受60－80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性 ③洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响 一、基础知识： 7、DNA的鉴定 DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂 二、实验设计 材料选取原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大 实验室通常选取材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取2～3种实验材料） （一）实验材料的选取 二、实验设计 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 1、动物细胞 动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可 讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂 细胞膜和核膜的破裂 ，从而释放出DNA 二、实验设计 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 1、动物细胞 2、植物细胞 ①植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜 讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？ 答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解 二、实验设计 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 1、动物细胞 2、植物细胞 ②实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行从分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液 讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？ 答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等 二、实验设计 （三）去除滤液中的杂质 为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理 讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？ 答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质 二、实验设计 （三）去除滤液中的杂质 讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？ 答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离 二、实验设计 （四） DNA的析出与鉴定 1、DNA的析出 DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95 ％） ，静置2－3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水 二、实验设计 （四） DNA的析出与鉴定 1、DNA的析出 2、DNA的鉴定 鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L 的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4ml 试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色 三、鸡血细胞液中DNA的粗提取实验流程图 三、鸡血细胞液中DNA的粗提取实验流程图 三、鸡血细胞液中DNA的粗提取实验流程图 三、鸡血细胞液中DNA的粗提取实验流程图 三、鸡血细胞液中DNA的粗提取实验流程图 5、过滤→取纱布上的滤物 纱布过滤 6、再次溶解DNA 2mol/LNa