第18章 重组DNA技术 12月21号.ppt

一、原核表达体系 1. 不同表达方式的优缺点 (1) 非融合型表达 ◆ 优点：与真核生物体内蛋白质结构最相似，功能 最相近。 ◆ 缺点：容易被细菌蛋白酶所破坏。 (2) 融合型表达 ◆ 优点：可以抵御细菌蛋白酶的破坏，融合蛋白比 天然的外源蛋白更加稳定 ◆ 缺点：需要去除原核多肽。 ◆ 原核多肽切除方法：化学裂解法和酶解法。 (3) 分泌表达 ◆ 优点：防止大肠杆菌对表达产物的降解，减轻大肠 杆菌代谢负荷和恢复表达产物天然构象。 ◆ 包涵体益处：防止蛋白酶对表达蛋白的降解，有利于表达产物分离纯化。 ◆ 包涵体缺点：表达蛋白不具有生物活性，必须溶解包涵体并对表达蛋白进行复性。 2. 包涵体(inclusion body) ◆ 是大肠杆菌高效表达外源基因时形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与细胞质中的其他成分有明显的区别。 二、真核表达体系 1. 酵母表达体系 (1) 酵母表达体系具有诸多优点： ① 可以对蛋白进行多种翻译后修饰 ② 培养简单 ③ 自身分泌蛋白少，是理想的分泌型表达系统 ④ 具有较高的安全性，如啤酒酵母表达体系 ⑤ 分离纯化的过程比较简单 (2) 酵母表达体系实例 干扰素、人表皮生长因子、人乙型肝炎表面抗原 和核心抗原等。 2. 哺乳动物细胞表达体系 ◆ 优点： ① 可表达克隆的cDNA，也可表达真核基因组 DNA。 ② 表达蛋白可被适当修饰。 ◆ 缺点： ① 操作技术难 ② 费时 ③ 成本高 三、重组蛋白质分析鉴定 检查内容 分析方法 鉴定标准 分子量 SDS银染一条带 等电点 等电点聚焦电泳 银染一条带，扫描95%以上 纯度 HPLC 层析一个峰(95%以上) Western Blot 有一条活性蛋白带 结构分析 氨基酸组成分析 各种氨基酸比例符合设计 氨基酸序列分析 N-末端15个氨基酸符合要求 肽谱图 符合定点降解 生物学 活性 细胞或动物实验 符合比活性和特定生物学检测指标 重组蛋白质的鉴定方法及标准 四、重组蛋白质药物制备 ◆ 生物制药领域的上游技术包括基因克隆、表达载体构建与表达；下游技术包括蛋白质的分离纯化。 ◆ 重组胰岛素是第一个投放到市场的重组蛋白质药物。 ◆ 胰岛素的重组表达以礼莱(Lilly)公司的E. coli表达体系和诺和诺德(Novo Nordisk)的酵母表达系统为代表。 本章小结： 1. 重组DNA技术、广义遗传工程和狭义遗传工程、克隆、限制性内切酶、Ⅱ型限制酶。 2. 载体、载体的条件、克隆载体（pBR322）、表达载体、载体的特点、载体的种类、pUC系列载体的特点与优点、人工染色体、表达载体的结构特点与表达特点、酵母表达载体结构特点与表达形式、哺乳动物表达载体。 3. DNA重组的基本过程、目标序列的来源与制备方法、 基因文库、cDNA文库、重组分子导入宿主的方法 (转化、转染和感染)、感受态细胞、重组子的筛选与 鉴定方法。 4. 重组基因表达体系的创建过程、表达体系的分类、不 同表达方式的优缺点、包涵体、酵母表达体系(优缺 点)、哺乳动物细胞表达体系(优缺点)、重组蛋白质的 鉴定方法与标准、生物制药领域的上游技术与下游技 术。 * 【B】国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪：口、蹄及舌头呈现出绿色荧光的转基因克隆小猪日前在东北农业大学顺利降生，是世界上继美国、韩国、日本之后的第四例成功通过体细胞核移植方式生产出的绿色荧光蛋白转基因猪 ，该技术就可以应用于家猪的转基因育种、人类疾病医疗模型猪的建立以及生产为人类器官移植提供器官的特殊家猪，并将为畜牧业发展和医学研究提供新的“资源”。 【C】A tobacco plant expressing the gene for firefly luciferase. Light was produced after the plant was watered with a solution containing luciferin, the substrate for the light-producing luciferase enzyme (see Box 13-1). Dont expect glow-in-the-dark ornamental plants at your local plant nursery anytime soon. The light is actually