4基因工程载体分析.ppt

　 G418是一种氨基糖苷类抗生素，这种氨基糖类抗生素的结构和新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，在分子遗传试验中，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。当neo基因被整合进真核细胞DNA后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。Ｇ418的这一选择特性 ，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。 大质粒！ ①载体片断自我连接。 ②外源DNA片断自我连接。 ③多个本来不在一起的外源DNA片断连接起来同时插入载体。 （7）cosmid载体克隆的缺点 用碱性磷酸酶除去线性质粒片断5’端的磷酸，可防止载体自体连接。 克服载体自体连接的改良方案： ① Ish-Horowice—Burke改良方案 1981年，D. Ish-Horowice和J.F. Burke 。 （8）cosmid载体的改良 在BamH I位点两侧各有一个EcoR I切点。 1）突出的特点： pJB8 cosmid载体 使克隆在BamH I上的外源DNA可被EcoR I切下来。 包装识别 2）Ish-Horowice—Burke方案克隆过程 HindIII SalI SalI HindIII BamHI a. 需要脱磷酸化处理。 b. 电泳纯化载体两臂。 c. 载体两臂的最终得率少的可怜！ 2）Ish-Horowice—Burke方案的缺点 防止载体自我连接 第二次酶切后。 1983年P.F. Bates和R.A. Swift ② Bates---Swift 改良方案 a. 具有两个cos位点。 SmaI平端的连接效率低，阻止了载体臂的自我连接，增加了外源DNA的连接效率。 1）特点： b. 一个SmaI切点把两个cos位点分开。 c. BamHI克隆位点。 c2XB cosmid载体 Bates---Swift 克隆过程： 第三节 大分子DNA克隆载体 A.W.Murray 1983年形成基础理论, D.T.Burke等1987年变为现实。 一、酵母人工染色体 1. YAC的特点： （1）只能在酵母细胞中扩增。 （yeast artificial chromosome, YAC) （2）克隆容量大，为230kb-1700kb。 （3）构建原理:按染色体结构构建。 （1）DNA复制起始点（ori） 2. 染色体复制和遗传的三个基本组件： TEL TEL CEN ORI （2）着丝粒（centromere，cen） （3）两个端粒（telomeres，tel） Leu ARS CEN Leu- Yeast 后代死 Leu- Yeast 80%后代死 Leu- Yeast 后代活 Leu- Yeast 后代死 Leu- Yeast 后代活 Tel Tel （1）着丝粒区（CEN） A A GTCACGTG T TGTTTCTGNTTTCCGAAA 3. YAC的组成结构 酵母染色体着丝粒区的保守序列: 78-86bp I II III 由三个区组成 酵母第3、4、6、11号染色体的着丝粒区序列： 酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重复序列。 （3）复制起点（ORI） 约100bp的自主复制序列（ARS）。 （2）端粒（TEL） 人是TTAGGG重复序列; 四膜虫是 GGGTTG重复序列。 （真核生物中只有酵母菌有ARS） 两个端粒序列Tel。 位于 SUP4 基因内部。 （4）克隆位点 插入失活选择： SUP4酶失活的酵母菌落呈红色； 不失活的菌落是白色。 14 TRP1、URA3（分别位于两臂）。 细菌的复制起点 ori和抗生素标记Ampr （5）在酵母中的标记基因 （6）在细菌中操作 4. YAC克隆外源DNA URA3 TRP1 CEN4 （1）宿主酵母菌： 只有同时得到YAC的两个臂，才能在基本培养基（不加TRP和URA）上生长。 （2）选择方式 5. YAC转化过程 trp- 和 ura- cen ura3 trp1 SUP4酶失活的酵母菌落呈红色； 不失活的菌落是白色。 （1）存在插入子的稳定性问题。 6. YAC的缺点： （2）同一酵母细胞内多个YAC引起交换 （3）转化效率低。 （4）难以制备纯的YAC-DNA。 结合组蛋白 H. Shizuya等1992年在大肠杆菌F因子的基础上构建的。 （2）克隆容量可达300kb。 二、细菌人工染色体（BAC） 1. F质粒的特点： 每细胞只有一个拷贝，不会重组。 （4）便于提纯 像提取质粒一样直接提纯。 （1）单拷贝复制。 （3）比较稳定。 （1）OriS和repE控制质粒的单向复制。 （2）parA和pa