4大规模测序及一二三代测序仪介绍分析.doc

大规模测序 1.RNA测序（RNA Sequencing）—高速序列比对 2.转录组测序（Transcriptome sequencing） 3.宏基因组测序 1.转录组是指某个物种的特定组织或细胞在某一生理功能状态下所有转录的mRNA产物的集合，是基因组遗传信息传递和表达的重要步骤和过程。 高通量转录组测序可以获得大量转录本序列信息，定量基因转录表达水平，获得基因组转录区域及其位点信息等，在基因组序列拼接注释、样品间基因转录差异表达（差异表达分析为考点）及其功能研究等方面有重要作用。1. 有参考基因组的转录组分析技术路线 推荐平台：Illumina HiSeq 2000、Illumina MiSeq 2. 无参考基因组的转录组分析 推荐平台： Roche 454 FLX+二、生物信息学分析1) 有参考基因组的转录组1. 原始数据整理、过滤及质量评估2. 转录组测序分析? 与参考基因组比对? 蛋白编码基因的表达量分析? 蛋白编码基因的表达量差异分析? 差异表达的蛋白编码基因的聚类分析（热图）? 差异表达基因富集分析（GO、KEGG）? SNPs的分析（SNPs鉴定、同义/非同义突变、与已有SNPs数据库比对）? 可变剪切分析? UTR区域鉴定? 新基因/新转录本分析3. 根据客户需求进行个性化分析2) 无参考基因组的转录组1. 原始数据整理、过滤及质量评估2. 转录组测序分析：? 序列拼装及拼装统计? Unigene功能注释? Unigene的功能聚类分析（KOG、GO）? Unigene的代谢途径分析（KEGG pathway）? Unigene的表达量分析? Unigene的表达量差异分析? 差异表达的Unigene的聚类分析（热图）? 差异表达的Unigene的富集分析（KOG、GO、KEGG）? SNPs的鉴定3. 根据客户需求进行个性化分析四、经典案例案例1：人前列腺癌融合基因鉴定背景：人前列腺癌发病率位于男性恶性肿瘤的首位，并且发病率近年呈上升趋势。目的：对人前列腺癌及癌旁组织基因转录组进行检测分析。了解人前列腺癌的种族特异性及其可能的分子生物学机制。结果：人前列腺癌的融合基因具有种群特异性，在欧美人群中普遍高频表达（50-80%）的融合基因TMPRSS2-ERG在中国人群中的表达率仅有20%左右，而在欧美人群中尚未发现的融合基因CTAGE5-KHDRBS3和USP9Y-TTTY15在中国人群中却有很高的表达频率，分别为37%和35.2%。案例2：玉米不同发育阶段转录组研究背景：在单子叶植物中，分生组织分化产生叶片和叶鞘。玉米叶片发育的整个顺序都是沿着长度分布的，不同的部位也呈现出不同的发育阶段。目的：对玉米叶片转录组进行分析，了解基因结构和表达差异。结果：定位了超过120 Mb条序列，定量叶片各发育阶段中成熟维管束鞘和叶肉细胞中的转录本丰度，发现在发育各个阶段的维管束鞘和叶肉细胞中分别有64%和21%的基因差异表达。同时发现一个动态转录组，其中叶基部初级细胞壁和基本细胞代谢的转录本向顶端次级细胞壁生物合成和C4光合作用的转录本转变。案例3： 西葫芦（基因组未知）转录组研究背景：西葫芦属于葫芦科，富含维生素等营养成分，是一种重要的蔬菜。然而与其相关的研究报道较少，限制了分子育种的发展。目的：采用Roche 454 FLX对西葫芦的根、叶、花等组织进行转录组测序，分析SSR和SNPs位点。结果：通过从头组装获得平均长度为626 bp的unigene 49,610条。发现超过60%的unigene被注释分类到一个或者多个GO分类信息中。在检出的SSR中共有1,882种基序类型和9,043个SNPs位点。大量的分子标记，为遗传性状和数量性状位点分析发挥了重要的作用。五、 常见问题解答1. Q：转录组测序与基因表达芯片相比有哪些优势？A：与基因表达芯片相比，转录组测序具有如下优势：首先，应用范围广。转录组测序无需预先设计探针或了解物种的基因组信息，同样适用于基因组序列未知物种；第二，准确性高。基因芯片原理是基于核酸单链间的互补杂交，当杂交条件不同时，或者丢失低拷贝转录本信息，或者假阳性率高。而转录组测序是基于对转录本序列的测定，准确性很高，而且当测序深度足够时，能够检测到极低低丰度表达的转录本信息。第三，信息丰富。转录组测序除了可以用于基因组注释和基因转录表达分析，而且能发现新基因，检测可变剪切，SNPs，融合基因等。因此，转录组测序在诸多方面优于基因表达芯片，已经成为基因注释、表达检测和发现新基因等方面的主流技术。2. Q：如何进行原核生物转录组分析？A：针对原核生物的mRNA没有poly A尾巴的情况，需要提供去