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生化药物常用分析方法 北京市药品检验所生化生检室 高春 1．生化药物的概念 生化药物是运用生物化学的研究成果，把生物体产生的各种基本物质用于预防、诊断和治疗疾病的一大类药物。包括从动物、植物、微生物等生物体中提取分离的天然物质及部分化学合成产物。通常所说的生化药物是专指在生物体内起重要生理作用的生命基本物质。如：氨基酸、多肽、蛋白质、核酸及其降解物、酶与辅酶、维生素、激素、糖与脂类等一大类药物。 2. 生化药物的分类 (1) 按其来源分：生化药物按其来源不同可分为植物生化药物、动物生化药物、微生物生化药物及合成生化药物。 (2) 按其化学性质及作用分：可分为氨基酸、多肽、蛋白质、核酸及其降解物、酶与辅酶、激素、维生素、糖、脂、有机酸等。 3. 蛋白质的含量测定 3.1 氨基酸及蛋白质的显色反应 3.2 凯氏定氮法 3.3 福林-酚试剂法 3.4 双缩脲法 3.5 紫外吸收法 3.2.3 凯氏定氮法一般步骤 4.3.5 酸纤维薄膜电泳操作步骤 4.4.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤 5.酶的测定 5.1 酶的概念： 5.2 酶的特点： 5.3 酶的专一性： 5.4 酶的分类与命名 5.5 酶的化学组成 5.6 酶促反应的影响因素 5.7 酶活力的测定方法 小结 1.生化药物概念 2.生化药物的分类 3.蛋白质的含量测定 4.电泳法 5. 酶的测定 5.6 酶促反应的影响因素 5.6.1 底物浓度对酶反应速度的影响 ?5.6.2 pH的影响与最适pH 5.6.3 温度的影响与最适温度 5.6.4 酶浓度的影响 5.6.5 激活剂的影响 5.6.6 抑制剂的影响 5.6.7 酶活力的测定方法 5.6.1 底物浓度对酶反应速度的影响 酶促反应中，酶先与底物形成中间复合物，再转变成产物，并重新释放出游离的酶。在酶浓度恒定的条件下，当底物浓度很小时，酶未被底物饱和，这时反应速度取决于底物的浓度，底物浓度越大，单位时间内ES生成的越多，而反应速度取决于ES的浓度，故反应速度也随之增高。当底物浓度加大后，酶逐渐被底物所饱和，反应速度的增加和底物的浓度就不成正比，续而底物增加至极大值，所有酶分子均被底物饱和，所有的E均转变成ES，此时的反应速度不会进一步增高。 5.6.2 pH的影响与最适pH 大多数酶的活性受pH影响较大。在一定pH下酶表现最大活力，高于或低于此pH，活力均降低。酶表现最大活力时的pH称为酶的最适pH。PH对酶反应速度的影响，主要有下列原因 （1） 影响酶和底物的解离 酶的活性基团的解离受pH的影响，有的酶必须处于解离状态方能很好的与底物结合，在这种情况下，酶和底物解离最大的pH有利于酶促反应的加速。 (2） 影响酶分子的构象 过高过低的pH会改变酶的活性中心的构象，甚至会改变整个酶分子的结构使其变性。 5.6.3 温度的影响与最适温度 化学反应速度随温度的增高而加快，但酶是蛋白质，可随温度的升高而变性。 5.6.4 酶浓度的影响 在一定条件下，酶的浓度与反应初速度成正比。因为酶催化反应时，酶先要与底物形成中间物，当底物浓度大大超过酶浓度时，反应达到最大速度，这时增加酶浓度可增加反应速度，反应速度与酶浓度成正比关系。这也是酶活力测定常用的方法。 5.7 酶活力的测定方法 酶的定量一般指测定酶的活力，由于酶不易提纯，一些酶制剂中常含有很多杂质，所以酶含量不能象化学药品用重量表示，而是用单位时间内催化某一特定反应的能力，即酶促反应速度大小，间接测得酶活力。一般用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。在实际测定过程中底物均过量，少量底物的减少难以准确测定，而产物从无到有，测定起来比较容易，所以中国药典上收载的品种大部分采用测定产物的方法。 酶活力的测定的三要素:温度;pH;时间 3.4.3．操作步骤 (1)标准曲线制备 每组取7支试管，依次加入蛋白质标准溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml，分别补足蒸馏水至3毫升，混匀后各管加2毫升碱性铜试剂，充分混和后，呈现紫色，立即于540nm下测定光吸收（以第一管作空白对照）。 (2)供试品测定 取3毫升样品溶液，加入碱性铜试剂2毫升，充分混匀后，于540nm下测定吸收值，操作条件同标准曲线。 3.4.4.注意事项 样品溶液与试剂混合后，有时约30分钟后有雾状沉淀 产生。这种现象对含脂肪类物质的蛋白质抽提液较易发生，而对于纯蛋白质溶液不明显。克服的方法有三种：（1）加入试剂后立即比色，至少应在30分钟内完成；（2）如沉淀已经产生，则可以放置二小时或更多时间，离心去沉淀后