分子生物学讨论课讨论题4教案详解.ppt

1.从/nuccore/网站中对该基因进行搜索，输入登录号：AK135903.1 预防医学1403班 小组成员：01 王璟 02 楚歆 03 宋娟 04 席玥 讨论题4 分子生物学第四次讨论 讨论题目： 已知目的基因的cDNA序列（GenBank登录号：AK135903.1），拟采用基因工程技术在哺乳动物细胞中表达该序列中的133-1941位核苷酸序列，请设计实验方案。 根据133-1941的序列，设计PCR引物 从cDNA中扩增该序列 得到扩增产物后将产物插入质粒 该质粒扩增后转染哺乳动物细胞，纯化后进行表达 1 2 3 4 我们的方案： 根据133-1941的序列，设计PCR引物 引物设计目的、原理及原则 1 搜索、设计引物 3 学习使用GenBank 2 根据原则筛选引物 4 引物设计的目的 目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。 引物设计的原理 1、 择合适的靶序列：设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计。? 2、 长度：一般来说，寡核苷酸引物长度为 15～30bp。? 3、 Tm 值：引物的 Tm 值一般控制在 55～60℃，尽可能保证上下游引物的 Tm 值一致，一般不超过 2℃。? 4、 （G+C）含量：有效引物中（G+C）的比例一般为 40～60％。? 5、 碱基的随机分布：引物中四种碱基的分布最好是随机的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的 3’端不应超过 3 个连续的 G 或 C。? 6、 引物自身：引物自身不存在连续 4 个碱基以上的互补序列，否则会影响到引物与模板之间的复性结合，尤其避免 3’末端的互补。 引物的设计原则（详见课本P.164） ① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ② 产物不能形成二级结构。 ③ 引物长度一般在15~30碱基之间。 ④ G+C含量在40%~60%之间。 ⑤ 碱基要随机分布。 ⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧ 引物5′端可以修饰。 ⑨ 引物3′端不可修饰。 ⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。 　　GenBank 是一个有来自于70,000多种生物的核苷酸序列的数据库。每条纪录都有编码区（CDS）特征的注释，还包括氨基酸的翻译。GenBank属于一个序列数据库的国际合作组织，包括EMBL和DDBJ。可使用它找到靶序列。 2.查询可知其序列为 3.直接在genbank中得到的引物序列结果 pair3、pair5的3端有三个连续的碱基，舍去。 pair1的3端末尾有碱基A，舍去。 pair6，pair7的3端末尾是碱基A，舍去。 所以，可用的引物序列为：pair2、pair4 /tools/primer-blast/搜索引物 点击 get primers后得到不同的引物方案 从cDNA中扩增该序列 （1）取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA ? 2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP(2 mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl；??（2）加入适量的ddH2O，使总体积达50 μl。轻轻混匀，离心；??（3）设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照；??（4）电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；??（5）密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。 一、PCR 主要原料 模板DNA TaqDNA聚合酶 引物（提前设计并合成与 目的DNA两侧互补的 引物，琼脂糖凝胶电泳， 分离和纯化PCR产物-） 二、利用PCR技术扩增目的基因 得到扩增产物后将产物插入质粒 真核表达载体 质粒的复制起始位点 便于筛选重组质粒的抗生素抗性基因: 四环素抗性基因Tetr 便于筛选转染细胞的药物抗性基因:氨芐青霉素抗性基因Ampr 真核表达元件:， 启动子、增强子、克隆位点、转录终止子信号和poly(A)加尾信号（保证新转录的mRNA能够有效地加上poly(A)）。 基因表达载体的构建 表达载体构建流程 获得人工质粒载体分子(pBR322) 用限制性核酸内切酶（BamH