定点突变技术方案.ppt

基因的定点突变 目录 二、定点突变的目的 一、定点突变的发展史 三、定点突变的原理 四、体外定点突变的方法 五、定点突变的方法改进 六、定位突变用途 七、应用前景 八、参考文献 一、定点突变的发展史 1983年，世界上第一株转基因植株(zambryski，1983)的获得标志着植物转基因时代的到来。 1984年，Paszkowski将NP皿I等嵌合基因克隆到E.coh质粒上，并用PEG转化烟草获得成功。 1985年，Horsch等创立了农杆菌介导的叶盘法转基因系统，大大简化了以往利用原生质体为受体的转基因体系，具有里程碑的意义。 ?1987年，Frommetal转化CAT基因，获得成功。1987年，Jcffersontal利用GUS作为报告基因，使转基因愈伤组织和植株检测变为方便快速，大大的提高转基因效率。1987年，美国康耐尔大学的Sanford等发明了基因枪。 1988年，ein首次将其用于植物转基因研究，克服了当时农杆菌介导的转基因方法的受体种类和基因型的限制，开创了植物转基因方法的新领域。McCabeetal利用基因枪法转化大豆幼胚和成熟胚的下胚轴获得了转基因再生植株。 1990年，From示etal利用基因枪法成功转化T玉米胚性愈伤组织。同年Fine:andMcmullen(1990)用陆地棉柯字310的胚性悬浮系进行的基因枪转化。获得了10个再生植株，较农杆菌介导的遗传转化，所用的再生时间较短(5个月)。其后，MeCabeandM inell报道T基因型独立的基因枪转化方法。 1994年，Hieital通过使用农杆菌侵染诱导剂乙酞丁香酮(AS)以及构建巧rG和巧rB高效表达的超双元载体，高效成功地转化了水稻。利用该转基因系统，Ishidaetal(1996)、Tingayetal(1997)和Chengetal(1997)相继获得了玉米、大麦和小麦的转基因植株。 二、定点突变的目的 基因定点的突变是指按照设计的要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换和重排等变异。 体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间关系的有力工具。 蛋白质的结构决定其功能，对某个已知基因的特定碱基进行定点改变，缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构和功能，改造酶的不同活性或者动力学特性。 三、定点突变的原理 定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。 四、体外定点突变的方法 （1）寡核苷酸介导的定点突变 （2）PCR介导的定点突变 （3）盒式突变 （1）寡核苷酸介导的定点突变 寡聚核苷酸定点诱变技术是由加拿大的生物化学家( michael smith )发明的. 寡核苷酸定点突变基本原理 合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，使其与带有目的基因完全互补。 合成的寡核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完全互补。 然后用DNA聚合酶使寡核苷酸引物延伸，完成单链DNA的复制。 由此产生的双链DNA，一条链为野生型亲代链，另一条为突变型子代链。 将获得的双联分子通过转导入宿主细胞，并筛选出突变体其中基因已被定向修改 （2）PCR介导的定点突变 在最初所建立的PCR方法中就可看出只要引物带有错配碱基便可使PCR产物的末端引入突变。但是诱变部分并不总在DNA的中间部分进行诱变。 目前采用重组PCR进行定位诱变，可以在DNA片段的任意部位产生定位突变。 （3）盒式突变 1985年Wells提出的一种基因修饰技术—盒式突变。 盒式突变：用一段人工合成具有突变序列的DNA片段，取代野生型基因中的相应序列。 然而，并非所有变异区附近都能找到合适的限制位点，如果不存在限制位点，就要用寡核苷酸指导的定位诱变引入限制位点。 五、定点突变的方法改进 设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。 DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。这个试剂盒非常巧妙的利用甲基化的模版质粒对DpnI敏感而合成的突变质粒对DpnI酶切