毕赤酵母表达实验手册（中文）.pdf

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. 毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。 然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰 胺化及 蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制， 不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二 硫键并折叠成 高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠， 是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活 性，为了得到有活 性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比 较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业 化的基因 工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。 但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的 加工 修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才 能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠 杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简 单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰， 合理 的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系 统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和 利 用。［1 ］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调 控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae ） 在 分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。 1981 年酿酒酵母表达了第一个外源基因干扰素基因［2 ］，随后又有一 系列外 源基因在该系统得到表达［3、4 、5 、6 ］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵 母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人 鼓舞， 但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷 贝数的选择压力消失［7 、8 ］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高 效表 达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. 验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产 量的下降［9 ］。为克服酿酒酵母的局限，1983 年美国Wegner 等人最先发展了以 甲基营养型酵母（methylotrophic yeast ）为代表的第二代酵母表达系统［10 ］。 甲基营养型酵母包括：Pichia 、Candida 等．以Pichia.pastoris （毕 赤巴斯德酵母） 为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系 统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外， 还有以下 几个优点［1、9、11 ］； ⑴ 具有醇氧化酶AOX1 基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子 之一。 ⑵ 表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。 ⑶ 菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。 ⑷ 毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解， 而且减少对细胞的毒害作用。 Pichia.pastoris 基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表 达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中， 能使产物 有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子AOX1 ， 已高效表达了HBsAg 、TNF、EGF 、破伤风毒素 C 片段、基因工程抗体等多种 外源基因［11