新型乙型肝炎病载体的构建及初步应用研究.pdf

中文摘要 新型乙型肝炎病毒载体的构建与初步应用研究 摘 要 乙型肝炎病毒(HBV)载体是近几年新发展的一种病毒载体，不 仅具有天然嗜肝特异性，而且具备改造为肝靶向性基因治疗载体的基 本条件。主要包括：在肝细胞内持续复制、反复感染，病毒本身对细 胞没有明显的细胞毒性；能够携带外源基因并被包装成病毒颗粒；能 够介导外源基因的转移和表达；但由于基因结构复杂，目前改造的 HBV载体均存在载容量小、复制包装效率低及安全性差等缺点，而 且HBV载体制备困难，感染效率低，为解决目前存在的困难，有必 要使其与其他病毒载体联合应用。如与腺病毒载体、慢病毒载体、杆 状病毒载体或逆转录病毒载体联合应用，实现高载容量、高转染效率、 高复制能力，充分发挥HBV载体嗜肝导向性，可以利用体内野生型 HBV为之提供包装，在体内形成具有抗HBV作用的HBV样颗粒， 或携带治疗性目的基因，进一步感染其他肝细胞，实现放大效应。因 此，通过病毒载体之间的重组，拓宽了HBV载体应用领域，不仅有 望用于抗HBV基因治疗，也可以用于制备DNA疫苗、筛选抗病毒 药物或通过携带外源性标志基因用于HBV分子生物学研究等。本研 究通过构建新型的HBV’载体表达不同的目的基因，构建了持续分泌 选HBV易感细胞系；或与腺病毒载体联合构建了表达MMP8等目的 基因的质粒，用于抗肝硬化的基因治疗，为HBV的分子生物学研究 和肝硬化的生物治疗等开辟了新途径。本研究共分3部分完成。 第一部分新型tlBV载体的构建 目的应用分子生物学技术改造HBV载体，阻断其结构基因的表 达，提高HBV载体作为基因治疗载体的安全性，使其更适用于作为 基因治疗载体。 方法： 1 中文摘要 and pre．S2、SX等结构蛋白的表达，构建pCH．M5．GFP质粒。 2 和pCH．M5．hRLuc两个质粒。 3外源基因的表达能力的检测HBV载体经基因改造后，通过质 粒共转染肝细胞，应用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，应用荧 -光素酶检测试剂盒检测海肾荧光素酶的表达水平，鉴定新构建质粒 力。 4重组HBV复制能力的检测。与辅助质粒共转染后，提取细胞裂 解液中的HBVDNA，Sorthemblot技术检测重组HBV复制能力。 5重组HBV感染树购肝细胞能力的检测。原代培养树嗣肝细胞， 感染浓缩的重组HBV颗粒1W后，观察细胞内GFP的表达水平。 结果： l成功构建了不能表达HBV结构基因的新型HBV载体。 2新型HBV载体外源基因的表达水平基因突变后表达GFP的 质粒转染肝癌细胞系后，GFP表达水平明显强于原始质粒。 3通过southem blot检测在细胞裂解液中能够形成HBV复制中 间体。 4重组HBV感染树驹肝细胞lW后，能够观察到GFP。 结论：‘HBV载体通过变更起始密码子和终止密码子后，阻断结 构基因表达，在S基因区插入报告基因GFP和hrLUC，构建了新质 粒，其外源基因的表达水平高于对照原始载体质粒，能够形成HBV DNA复制中间体，而且形成的重组HBV能够感染树驹肝细胞。 细胞系的构建 目的： 构建一个持续分泌重组HBV的细胞系，该重组HBV表达杀稻 瘟菌素抗性基因(BsdR)。 方法： 1构建具有G418抗性的无包装信号的HBV辅助质粒 中文摘要 pcDNA3．1．CH3142与表达BsdR的HBV载体质粒。 选，获得阳性细胞克隆。 的细胞系。 4 Western G418反复加压培养，Southernblot和Nativeblot技术， 再次筛选，获得高表达Bsd的重组HBV的细胞系，并通过PCR技术 检测重组HBV的表达水平。 所构建细胞系无野生型HBV形成。 6应用免疫电镜技术观察到完整的有囊膜包被的重组HBV颗 粒。 结果： 1转染后，经G418筛选后，获得50余个细胞克隆。 2挑选其中36个进行扩增，经同位素标记探针斑点杂交法检测 细胞上