小胶质细胞的激和抑制在大鼠视网膜光损伤模型中的作用研究.pdf

复旦大学博士论文 中文摘要 小胶质细胞的激活和抑制在大鼠视网膜 光损伤模型中的作用研究 中文摘要 第一部分t视网膜小胶质细胞在大鼠视网膜光损伤模型中的作用 选用成年雄性SD大鼠，予缝线开睑，1％阿托品扩瞳，经24h暗适应后， 放入光照箱中接受24h强度为2500Lux的宽谱蓝光照射。在光照后的3d、7d、 14d应用光镜、TUNEL染色、透射电镜观察实验大鼠视网膜组织结构的改变及 细胞凋亡情况；应用闪光ERG评价视网膜功能。结果显示：光照后视网膜光感 受器的内外节破坏，外核层排列紊乱，核质固缩，核层逐渐变薄，14d时减少达 60．09％；光照后1d，外核层出现大量TUNEL(+)细胞，进一步经透射电镜证实 光感受器的死亡方式为凋亡；光照后14d，视网膜功能显著下降，0dB光照强度 不能诱导出Photic—ERG波形；模型眼出现与视网膜色素变性相似的以凋亡为特 征的光感受器变性。 在成功建立了大鼠视网膜光损伤模型后，我们又进一步研究了实验性视网膜 光损伤模型中小胶质细胞的迁移、活化及其与光感受器凋亡的关系。光照后2h、 细胞分别计数并绘制时间变化曲线，分析两者的关系，同时用EDl抗体寻找可 能的血源性巨噬细胞；用透射电镜观察进入光感受器层的小胶质细胞的吞噬行 为；用Real．timePCR和Western．blot法对光照后视网膜胶质源性致炎因子及神 经毒性物质IL．1 BmRNA及蛋白表达变化进行定量分析。 结果显示：光照后2h视网膜外核层即可见TUNEL(+)细胞，ld时达高峰， 3d后逐渐减少；光照后6h视网膜外核层开始出现少量OX42(+)细胞，逐渐增多 并于3d时达高峰，7d后渐消失，从时间变化曲线可见OX42(+)细胞的迁移高峰 落后并紧随凋亡高峰；视网膜铺片中见OX42(+)细胞由呈小细胞体和细的分支突 触的静息形态转变为肥大细胞体的激活形态；强光照射上调了视网膜IL．1B mRNA及蛋白的表达，其时间变化趋势同小胶质细胞的激活和迁移趋势基本一 致；透射电镜显示进入外核层的小胶质细胞吞噬了光感受器的外节膜盘；光照后 的晚期由于血视网膜屏障的破坏，极少量的血源性巨噬细胞向视网膜外层浸润。 复旦大学博士论文 中文摘要 本部分的研究发现视网膜光损伤模型中光感受器的凋亡诱导了小胶质细胞 向外层的迁移、活化及吞噬行为的发生，并伴有胶质源性神经毒性物质IL—lB的 上调，提示小胶质细胞在加速光感受器变性过程中发挥着重要的作用。 第二部分：纳洛酮对脂多糖诱导的视网膜小胶质细胞激活的影响 原代培养并分离纯化视网膜小胶质细胞，利用脂多糖(LPS)建立体外激活模 形态的影响；用酶联免疫吸附试验检测naloxone对LPS激活的小胶质细胞分泌 响。 实验结果显示：LPS活化的小胶质细胞呈典型的激活形态，表现为胞体显著 增大，胞膜突起变粗、皱褶，OX42阳性染色明显增强，呈“水母状”，lgM的(．)． 形态学变化，表现为更接近于对照组的轻度激活形态；此外naloxone预处理能 显著减少LPS引起的小胶质细胞释放IL．1B的增多，从量效曲线上看，naloxone 对LPS引起的小胶质细胞释放IL．1p的抑制作用呈一定的剂量依赖性和时间依赖 性，以lgM、12h效果最为明显，且异构体具有等效性；MTT比色法显示0．259M一- 1．25 J_tMnaloxone对_100ng／mlLPS处理的小胶质细胞的数量无明显影响。 本部分的研究发现naloxone能够有效抑制LPS活化的视网膜小胶质细胞的 增殖无明显影响，提示功能抑制；naloxone及其异构体对抑制活化的小胶质细胞 的形态变化及IL．1p的产生具有等效性，提示其抑制作用可能与阿片受体无关。 第三部分：纳洛酮对视网膜光损伤模型中光感受器变性的神经保护作 用 SD大鼠接受2500Lux的宽谱蓝光照射24h制成光损伤模型。实验组大鼠于 光照前2d接受不同剂量naloxone腹腔注射直至光照后2周，而对照组则接受等 量的PBS腹腔注射。用组织学和视觉电生理的方法来评价naloxone对光照引起 的光感受器变性的神经保护作用；用TUNEL染色观察naloxone对光照后光感受 器