十二指肠钩虫蛋酶抑制剂ad-kpi-2、ad-api-1的克隆及其表达研究.pdf

其表达研究 摘 要 【目的】 在实验室前期分离获得十二指肠钩虫融lIlitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂 Ad．KPI．2(G铋e；b锄k登录号：EF 495070)及天冬氨酸蛋白酶抑制剂Ad枷I．1 (G锄eballl【登录号：EF 的氨基酸序列进一步进行生物信息学分析；构建Ad．KPI．2及Ad．API．1成熟肽原 核表达系统，在大肠杆菌(E．∞厅)中融合表达Ad．KPI．2及Ad．APl．1，并分离 作用机制。研究结果将为进一步研究Ad-KPI．2及Ad．．API．1的生物学功能并探讨 它们在致病中的作用奠定基础。 【方法】 1．Ad．KPI．2和Ad．API．1的生物信息学分析 运用生物信息学软件分别对Ad．KPl．2和Ad．API-l的编码序列进行分 析，预测编码蛋白的结构及理化性质。 2．A．d．Ⅺ，I．2、Ad．API．1的原核表达载体的构建、表达及纯化 序列，相应编码序列经双酶切后分别连接到表达载体pE■32a中，经鉴定正确的 表达重组融合蛋白Ad．KPI．2、Ad．API-l用Ni亲和层析柱进行纯化备用。 3．Ad．KPI．2的活性测定 运用发色底物法检测重组融合蛋白Ad．KPI．2对a．胰糜蛋白酶、胰弹性蛋白 酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的抑制活性情况。 【结果】 1．生物信息学分析表明：Ad．KPl．2由84个氨基酸残基组成，其成熟肽由 68个氨基酸残基组成，分子量为7923．9Da，等电点为6．15，含有典型的Kl】11itz 型结构域，是一种Kl“tz型丝氨酸蛋白酶抑制剂。Ad-API．1由228个氨基酸残 Da，等电点为 基组成，其成熟肽由213个氨基酸残基组成，分子量为23754．8 5．79，含有P13结构域，是一个典型的天冬氨酸蛋白酶抑制剂。 IPTG诱导获得了重组Ad．KPI．2和A“蛆I．1，并用镍亲和层析获得了纯化的重 组蛋白。 3．初步实验表明重组融合蛋白TⅨ．Ad-loI．2对伐．胰糜蛋白酶和弹性蛋白酶 具有显著的抑制作用，但对胰蛋白酶和胃蛋白酶无抑制作用。 【结论】 经生物信息学分析表明Ad-KPI．2是一种Kullitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂， Ad．API．1是一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂。本文成功构建了原核表达质粒 白酶和弹性蛋白酶具有显著抑制作用。本文首次对十二指肠钩虫两种蛋白酶抑制 剂Ad．KPI．2及Ad．API．1进行了生物信息学分析、克隆及表达研究，并初步检测 虫寄生生活中的生物学功能，了解它们在致病中的作用奠定基础。 关键词：天冬氨酸蛋白酶抑制剂；KllIlitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂；Ad．10I．2； Ad．API．1；生物信息学分析；原核表达；纯化；抑制活性；十二指肠钩虫 2 and of inhibitor CIoningexpressionprotease Ad一■：PI一2andAd．API—l AbstI·act objective ’nlese铆o p∞teill弱einllibitors，Ad—KPI-2(G∞ebankNO．EF495070)锄d ID：EF49013 werc isolatcd硒mmeh啪觚 Ad-API—l(Genebank 1)，Ⅵ惋ch previous our hookw伽鸭彳刀钞加幻—埘幽D锄口昆，bylaborat0珥Thispaperw弱t0觚alyze bioill细ma廿csoftheAd-l(I’I-2锄dAd枷I·ltll∞c10ne锄d exp麟sⅡ地matl玳 Ad-KPI-2锄dAd枷I-l Ad-KPI·2andAd-API．1 we