以vegf及其体为靶点联合多途径诱导白血病细胞株增殖、凋亡的实验研究.pdf

摘要 中文摘要 国内外研究结果显示，各类型白血病细胞均较高表达血管内皮细胞生长因 endothelial 子(vascular growthfactor,VEGF)。VEGF为已知最强，特异性最高的 血管生成调节因子，除在恶性肿瘤血管生成过程中发挥重要作用外，可直接刺 激髓系白血病细胞增殖，诱导白血病细胞抵抗化疗药物引起的细胞凋亡。VEGF 通过二聚体形式与受体结合，从而发挥相关生物学功能，因而针对VEGF及其受 体为靶点实施干预，可能为白血病治疗提供新惊喜，为后期临床运用相关抗血 管生成策略治疗白血病提供实验依据。 第一部分白血病细胞株中VEGF及其受体表达水平检测 目的：检测多种白血病细胞株中VEGF及其受体的表达水平，探讨相关基因 在白血病细胞生物学行为中的意义。方法：体外培养多种白血病细胞株(Na4、 PCR、Western blot等技术检测白 U937、K562、Jurkat)，应用RT-PCR、Real-time 血病细胞株及正常对照细胞中VEGF及受体表达的水平。结果：检测显示4株白 2．07，1．13。Westernblot结果显示4株白血病细胞均表达VEGF及其受体，而正常 对照组仅少量表达VEGF。结论：白血病细胞不同程度表达VEGF及其受体，各 作用于细胞膜上的VEGFRl受体而发挥生物学作用。 第二部分应用ShRNA构建VEGFRl基因沉默白血病细胞株 目的：应用慢病毒载体ShRNA靶向沉默高表达受体VEGFRl，探讨应用分子 生物学技术对细胞进行干预，构建敲除VEGFRl表达的白血病细胞株。方法：构 建慢病毒ShRNA干扰载体，转染入目的细胞，靶向沉默VEGFRl基因表达，应用 RT．PCR、Real-timePCR、Western blot等检测目的基因敲除效果。结果：构建 入慢病毒载体的序列通过PCR、测序等鉴定，与设计序列相同；转入U937细胞中， 摘要 Western blot可见VEGFRl蛋白表达量较空白载体对照组明显减少。结论：靶向 出KD．VEGFRl．U937稳定细胞株。 第三部分药物诱导白血病细胞细胞增殖及凋亡的实验研究 目的：本实验探讨以VEGF及VEGFRl为靶点联合应用单克隆抗体 (Bevacizumab)和常规化疗药物对多种白血病细胞株生物学行为的影响，研究体 外应用ShRNA，单克隆抗体和药物对白血病细胞株增殖、凋亡的影响。方法： 体外培养白血病细胞株、KD．VEGFRl白血病细胞株：应用CCK-8法检测经 Bevacizumab及不同浓度药物作用于体外培养细胞后细胞增殖、抑制率：流式细 结果： 常U937细胞增殖，呈明显的量效关系，而对KD-VEGFRlU937细胞作用不明显， 与NC组比较差别有统计学意义(PO．05)；流式检测显示正常U937细胞经VEGF 作用后，凋亡率较对照组细胞减少妒0．05)，而Bevacizumab作用组细胞凋亡率 较对照组有所增加，但差异无统计学意义∽0．05)；联合VEGF、Ara-C组作用 48h后，细胞凋亡率较单用Ara-C组凋亡率增加(尸0．05)，联合应用VEGF、 KD．VEGFRl U937细胞中，各组作用后与Ara-C组均无明显差异俨0．05)。结论： VEGF可明显刺激部分白血病细胞增长，抵抗化疗药物诱导的凋亡作用； Bevaeizumab可通过中和VEGF在一定程度上抑制细胞的增殖，提高白血病细胞 对化疗药物的敏感性；ShRNA沉默VEGFRl表达，可阻断VEGF的作用，抑制细 胞生长，增强白血病细胞对化疗药物敏感性。 关键词：白血病细胞株；血管内皮生长因子；贝伐单抗；RNA干扰；细胞增殖； 细胞凋亡 II Abstract ABSTRACT vascula