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Toll样受体信号对表皮黑素细胞天然免疫功能的影响和意义 中文摘要 Toll样受体信号对表皮黑素细胞天然免疫功能的影响和意义 关键词： 人黑素细胞；白癜风；Toll样受体；凋亡 中图分类号：R75 白癜风是一种常见的原发性的、获得性的皮肤色素脱失性皮肤、粘膜疾病， 以大小不等、数目不定的色素完全脱失斑为典型皮损。目前认为其发病是多基因 遗传的、在多种内外因子的激发下表现为免疫功能紊乱，导致表皮黑素细胞破坏， 终至色素脱失。彻底阐明白癜风的发病机制特别是免疫机制对于探索到治疗白癜 风的新靶点有着非常重要的意义。 在白癜风中尽管存在自身免疫异常的证据，但是导致针对黑素细胞自身抗原 的细胞和体液免疫是如何触发的问题仍有待解决。根据Matzinger的危险信号学 说，体内的细胞损伤等危险信号可激活APC来活化适应性免疫反应，在白癜风 自身免疫反应的触发期，往往存在皮肤黑素细胞生物学特性的异常，例如，外源 性机械刺激、烧伤、过度紫外线照射以及化学物质的刺激会导致局部黑素细胞处 于应激状态，而这种应激状态是否导致黑素细胞的免疫学特性发生改变，从而激 发或者放大随之而来的针对黑素细胞抗原的适应性自身免疫反应，还需要的研究 证实。但是毋庸置疑的是黑素细胞的天然免疫特性可能在联结黑素细胞应激反应 与自身免疫免疫反应中起到了重要的桥梁作用。 近年来对黑素细胞的研究，特别是对其生物学特性及细胞生化方面的研究已 经较为深入，许多证据都表明黑素细胞与皮肤免疫系统之间有密切联系。体外培 受体等免疫分子，并且能够被IFN吖和TNF．仪上调表达；黑素细胞自身还能分泌 的重要成员，并且可能以更加主动的方式参与并调节免疫反应。 TLRs被认为只表达在免疫细胞和多种炎症细胞表面，如树突状细胞 (Dendritic cells，DC)、巨噬细胞和T、B淋巴细胞等，与其相应的配体结合后可 以激活免疫细胞使其分泌大量的促炎性细胞因子和趋化因子，参与活化天然免疫 应答和特异性免疫应答，构成机体免疫系统的第一道防线。近年来，有报道指出 除免疫细胞外，多种组织细胞也表达TLRs，例如皮肤角质形成细胞表达不同的 TLRs，与TLRs相应配体结合后被激活，分泌大量的细胞因子和趋化因子。 由上述关于白癜风发病机制和TLRs生物学功能的研究，我们设想：黑素细 胞可以表达功能性TLRs，TLRs与其内外源性配体结合后引发黑素细胞生物学及 免疫学表型和功能的变化，这种变化很可能与白癜风自身免疫反应的发生和发展 Toll样受体信号对表皮黑素细胞天然免疫功能的影响和意义 中文摘要 有着密切的联系。尽管这种联系存在着诸多疑问。一旦这些疑问得到解决，我们 将发现一个新颖的角度解释白癜风的发病机制，并有希望将该通路作为新的治疗 靶点应用于白癜风的临床治疗。 第一部分Toll样受体在人表皮黑素细胞上的表达 一、正常人黑素细胞原代培养及传代鉴定 原代培养细胞24h后开始贴壁，可见角质形成细胞间散在的多级树突状细 胞，大部分细胞胞体圆而小，有两个对称树突，突起长短不等；少数细胞胞体大， 呈多角形，有2个至数个树突。约14天后可传代，根据角质形成细胞和黑素细胞 对胰酶的不同耐受性和成纤维细胞不能耐受G418的特性可分离出纯黑素细胞。 显微镜下可见系胞质及树突呈棕褐色或黑色，多巴染色结果呈阳性。我们采用 RT．PCR法对体外培养的第三代黑素细胞进行鉴定，结果显示，角质形成细胞特 异性标记分子keratin10和keratin14，成纤维细胞的特异性标记分子AS02均不 能被扩增，证明用上述培养传代方法制备的第三代黑素细胞纯度较好，可用于进 行下一步试验。 二、TLR3在黑素细胞上表达的鉴定 为了定性证明各TLRs成员在黑素细胞上的表达，我们以体外培养的第三代 黑素细胞为对象，并且以正常人外周血PBMC作为阳性对照，采用RT．PCR法 10。我们采用间接免疫荧光标记和流式细胞术在蛋白水平证明黑素细胞上TLR2， 4，7和9的表达。为了揭示黑素细胞上表达的TLR3的亚细胞定位，我们采用 间接免疫荧光和流式细胞术对黑素细胞膜上和胞内可能存在的TLR3进行检测。 结果证实：黑素细胞上表达的TLR3主要定位于细胞内。 疫印迹检测。结果显示：PVDF膜在TLR3的位置上出现了特异性的染色条带， kD左右，与文献报道的人TLR3分子量相符合