肿瘤动物模型和抗肿瘤药物的研究方法精要.ppt

三、肿瘤转移的常用体内模型 (一)B16-BL6小鼠黑色素瘤自发转移模型 [造模原理] B16细胞是1954年在C57BL/6小鼠耳根部皮肤上发现的自发性黑色素瘤细胞，移植后主要发生肺转移。 B16-BL6细胞来源于B16细胞，具有高度转移能力。将瘤细胞移植于局部，瘤体增殖生长后，侵袭周围正常组织和血管，进入血循环，到达远处部位发生转移，称为自发性转移。此模型可反映瘤”细胞侵袭－血行播散－侵袭”的完整转移过程，用于观察药物对肿瘤侵袭和转移能力的影响。 [操作方法] 1.瘤液制备 取对数生长期的B16-BL6细胞，吸弃培养液，用PBS洗净，用EDTA消化，加一定量培养液离心收集细胞，重悬于PBS中，将细胞浓度调整为1×107个/ml。 2.肿瘤接种 在每只C57BL/6小鼠后肢爪垫皮下注射50μl瘤液（含5×105个细胞）。 3.分组与给药 肿瘤接种次日将动物随机分组，设给药组、阳性对照药组（环磷酰胺100mg/kg）及实验对照组，每组10只小鼠，连续给药3周。 4.切除原发灶 给药3周后（瘤体≥10mm），称体重，乙醚麻醉下结扎股动脉后，截除荷瘤小鼠的后肢。 5.观察肺转移瘤灶 停药1d后，继续连续给药3周。于末次给药24h后，处死小鼠，解剖取肺，用Bouin液固定，在10倍解剖显微镜下计数肺组织表面肿瘤结节数。 黑色素瘤肺转移 (二)Lewis肺癌自发性肺转移模型 Lewis肺癌种植于动物皮下后可通过血行播散到肺部形成转移灶，故常被用作肿瘤血行转移研究的模型。Lewis肺癌移植于动物皮下、肌肉、爪垫等特定部位，移植瘤增殖后侵袭周围正常组织和血管，继之癌细胞进入血液循环形成血行播散，粘附于靶器官（主要是肺脏的血管壁）。 随后，癌细胞穿出血管，在肺内增殖最终形成肺转移瘤。上述移植后的增殖、侵袭、转移到最终形成转移瘤的过程，基本类似于人类肿瘤从生长到转移瘤形成所经历的一系列步骤，故称之为癌的“自发性转移模型。 Lewis肺癌是迄今研究肿瘤转移的首选模型。 八、细胞生长曲线法 [基本原理] 在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞数的对数（Y轴）对培养时间（X轴）作图，可得一条斜率向上的直线。但随着培养时间的延长，细胞密度不断增加，由于代谢产物的堆积及营养物质的消耗，细胞生长逐渐减慢以致停止，生长曲线的斜率逐渐变平，进入平台期。因此，药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来。 [操作方法] 以悬浮生长细胞为例。 1.选用对数生长期的肿瘤细胞，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液配成1×104个细胞/ml的悬液，在25ml培养瓶中接种5ml。加药组加入不同浓度的受试药物50 μl，实验对照组加入等体积溶剂。 2.细胞置37℃、5%CO2培养箱中培养，在培养后即刻及1、2、3、4、5、6和7d分别取样40μl，加0.4%台盼蓝染色液10μl，用血细胞计数板计数。以每毫升活细胞数的对数对培养时间作图，可得出生长曲线。 [结果评定] 1.药物对细胞的杀伤率 将实验对照组及加药组生长曲线的线性部分延伸至Y轴，可分别得到截距No和No，它们代表接种后具有增殖能力的细胞数，按下述公式计算药物对增殖细胞的杀伤率。 No－No 药物对增殖细胞的杀伤率（%） = ×100% No 2.药物对细胞倍增时间（TD）的影响 细胞倍增时间是指细胞数增加1倍所需的培养时间。以t代表培养时间，No和Nt分别代表接种细胞后和培养t小时后的细胞数。按下述细胞倍增时间计算公式计算倍增时间，如倍增时间延长表明药物抑制了细胞增殖，即增殖能力减弱。 0.301 t TD＝ lgNt－lgNo 第七节 肿瘤侵袭与转移的研究方法 肿瘤细胞具有多种生物学特性，其中侵袭和转移是最重要的特性之一，也是恶性肿瘤的重要标志。肿瘤侵袭(invasion)是指恶性肿瘤细胞突破基膜和细胞外基质(ECM)构成的组织学屏障，侵犯到邻近的正常组织，并在该处继续繁殖生长的过程。侵袭是贯穿肿瘤转移全过程的重要步骤，瘤细胞穿入、穿出血管或淋巴管和侵入靶器官都是侵袭行为的具体表现。 肿瘤侵袭是一系列多步骤的复