裂殖壶菌遗传转化体系及研究在DHA合成途径及研究中应用.pdf

裂殖壶菌遗传转化体系的研究及其在Ilia合成途径研究中的应用 裂殖壶菌遗传转化体系的研究及其在DHA合成途径研究中 的应用 摘要 二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)是一种极其重要的∞一3系列 不饱和脂肪酸，具有抗心血管病、抗癌、降血脂、促进智力发育和保护视力等重 有重要的经济价值而备受关注。对裂殖壶菌DHA合成途径的研究将对提高裂殖 壶菌的DHA含量有重要意义，因此本论文针对裂殖壶菌18SrDNA序列分析、一 遗传转化体系研究，克隆DHA合成相关基因并进行基因缺失等方面开展工作， 为研究裂殖壶菌的DHA合成途径奠定基础。 limacinum OUC88及以其为出发菌 首先，本论文从裂殖壶菌Schizochytrium 株经紫外诱变筛选的10个菌株中扩增出18S rDNA基因序列(序列长度为 rDNA序列比对分析。结果表明，＆ 1751bp一1758bp)，与GenBank中的18S limacinum FⅢ．512 OUC88以及10个派生菌株与同物种的Schizochytriumsp No．AY7583 1 (GenBank No．AB02207)的同源性均 84)、＆limacinum(GenBank 在96％以上；与同属异种的mangrovei(GenBankNo．DQl00293)只有93％的 同源性。并通过计算遗传距离及构建系统进化树，结果显示种内诱变产生的细微 变异小于同属内不同物种之间的变异，表明18SrDNA序列鉴定可作为诱变、转 基因等基因工程育种后物种鉴定的有效方式。 然后，作为建立遗传转化体系的基础，本论文研究Zeocin、两性霉素B (Amphotericin limacinum生 链霉素(Str)七种基因工程常用抗生素对裂殖壶菌Schizochytrium 长的影响。结果表明：Slimacinum对Zeocin最敏感，在2．5—4Zeocin中 I．tg／ml 较敏感，在14—20 G418中的成活率为2．08％(PO．01)，在25．5-68 txg／ml I．tg／ml氯霉素中成活率 13％左右(P0．05)；Slimacinum对氨苄青霉素、卡那霉素、链霉素不敏感，50．300 p∥ml的氨苄青霉素、卡那霉素、链霉素不能抑制其生长，成活率仍在80％以上 裂殖壶菌遗传转化体系的研究及其在DHA合成途径研究中的应用 (P0．05)。本研究为裂殖壶菌基因工程筛选标记的选择提供了实验基础。 随后，本实验参考NCBI的Genbank数据库中报道酐jpks基因序列，克隆了裂 殖壶菌OUCl68(Slimacinum 因。采用Zeocin作为抗性筛选标记，构建带有Zeocin抗性基因和部分pb基因的载 体(pTEF1／Zeo-pks1一U-D、pTEF 1／Zeo-pks1一M·D、pTEF1／Zeo-pks2-U-D、 转化，得到6株转化菌株，经Zeocin抗性基因扩增及Southern blottingi正实裂殖壶 勘鼢基因已成功实现定点突变。6株转化菌株分别为：一