《超分辨显微技术》.pdf

高级光学显微镜简介高级光学显微镜简介 高级光学显微镜简介高级光学显微镜简介 Karl Wang Microprobe Photonics Technology Co., Ltd 显微技术发展显微技术发展 显微技术发展显微技术发展 1671年，荷兰人Leeuwenhoek磨制成世界上第一架单式 显微镜； 1830年，英国人Lister提出用火石和冕牌玻璃制成物镜以 消色差和球差； 德国物理学家德国物理学家AbbeAbbe用衍射理论证明普通光学显微镜存在用衍射理论证明普通光学显微镜存在 分辨率极限；后来，Rayleigh给出具体的表达式 20世纪前半叶，出现暗场显微镜、偏光显微镜、相衬显微 镜、荧光显微镜、干涉显微镜、体视显微镜、倒置显微镜 和离心显微镜等。 显微技术发展显微技术发展 显微技术发展显微技术发展 激光共聚焦扫描显微镜是80年代发展起来的光机电一体化 的高科技显微镜，可以进行三维成像。LSCM的分辨率除 与激光波长有关外，还取决于针孔直径和物镜数值孔径； 近场光学显微镜(NSOM)，探头与被观察物的距离小于光 波长波长，，利用所谓利用所谓 ““光学隧道效应光学隧道效应””，，分辨率可达几纳米分辨率可达几纳米；； 透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM，探测二 次电子)； 扫描探针显微镜：扫描隧道显微镜(STM)，原子力显微镜 (AFM)，磁力显微镜，静电力显微镜，摩擦力显微镜等。 光学显微技术光学显微技术 光学显微技术光学显微技术 SPIM/HELM/SSIM TPM/MPM I2M/I3M/I5M CARS FLIM/FRET STED/STORM NSOM/TRIF 4Pi 共聚焦扫描显微镜共聚焦扫描显微镜LSCM 共聚焦扫描显微镜共聚焦扫描显微镜 LSCM以单色激光作为光源，并用附设光源针孔(pinhole)使光源成为 点光源。同时，在检测器前方也有一个检测针孔，点光源对标本内焦 平面上的每一检测针孔后的光电点扫描，标本上的被照射点在检测针 孔成像，由倍增管或冷电耦合器件逐点或逐线接受，迅速在计算机监 视器屏幕上形成荧光图像，光源针孔与检测针孔的位置相对于物镜焦 平面是共轭的平面是共轭的，，焦平面上的点同时聚焦于光源针孔和检测针孔焦平面上的点同时聚焦于光源针孔和检测针孔，，焦平焦平 面以外的点不会在检测针孔成像，这就是所谓的 “共聚焦”。 LSCM在普通光镜基础上引入共聚焦装置，该装置能够排除非焦平面 及焦平面非焦点光斑信息，大大提高分辨率和图象清晰度。在此基础 上，由于计算机及相应的软件技术组合，可以对较厚样品进行连续光 学切片及三维重建。 共聚焦扫描显微镜共聚焦扫描显微镜LSCM 共聚焦扫描显微镜共聚焦扫描显微镜 原理结构图 共聚焦扫描显微镜共聚焦扫描显微镜LSCM 共聚焦扫描显微镜共聚焦扫描显微镜 特点 1）普通光学显微镜的分辨率理论极限大约 是0.2微米，共聚焦显微镜的分辨率理论极 限大约是限大约是0.150.15微米微米。。 2 ）克服了传统荧光显微镜中焦面模糊的问 题，较好地解决了图像的轴向和侧向的干 扰。 3 ）成像速度较慢。 4 ）为获得足够的信噪比，需要提高激光强 度，容易导致标记染料的漂白；另外，还 可能产生光毒作用。 拉曼共聚焦显微镜拉曼共聚焦显微镜 拉曼共聚焦显微镜拉曼共聚焦显微镜 结合拉曼光谱技术 共焦显微拉曼的引 入实现了类似生物 切片的激光拉曼扫切片的激光拉曼扫 描，从而得到样品 在不同深度时的拉 曼光谱。 自适应扫描光学显微镜自适应扫描光学显微镜ASOM 自适应扫描光学显微镜自适应扫描光学显微镜 Thorlabs产品结构图 自适应扫描光学显微镜自适应扫描光学显微镜ASOM 自适应扫描光学显微镜自适应扫描光学显微镜 光学相干层析显微镜光学相干层析显微镜OCT 光学相干层析显微镜光学相干层析显微镜 光学相干层析成像(Optical Coherence Tomography,OCT) 技术是一新近发展的高分辨率的生物医学成像手段，它基 于低