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Molecular Marker and AFLP Technique 李星 分子标记的种类 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP) 。原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。 随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，缩写RAPD)：该技术用一个（有时用两个）随机引物（一般8－10个碱基）非定点地扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分开扩增片段。 SSR (Simple Sequence Repeat Polymorphisms)：引物根据与微卫星重复序列两翼的特定短序列设计，用来扩增重复序列本身。由于重复的长度变化极大，所以这是检测多态性的一种有效方法。 扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，缩写AFLP) 。 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，缩写SNP）技术。 AFLP 技术的基本原理 AFLP 技术是先将基因组DNA 用两种限制性内切酶 酶切成大小不等的酶切片断, 并与含有粘性末端的人工接 头相连, 形成不同酶切位点的限制性酶切片段, 然后用与 接头和位点相匹配的引物进行预扩增, 预扩增产物作为进 一步PCR 扩增的模板, 再选用特异引物进行选择性扩增, 扩增后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳将特异的限制性片 段分离。由于不同来源的DNA 的酶切片段存在差异, 因 而便产生了扩增产物的多态性。 技术流程 AFLP 技术的具体过程为 ①DNA 提取和质量检测; ②双酶切和酶切片段连接; ③酶切连接片段的预扩增; ④选择性扩增; ⑤PCR 产物变性后在聚丙烯酰胺变性凝胶上电泳; ⑥将电泳后的凝胶进行银染显影并拍照保存。 DNA 酶切及人工接头的连接(Restriction of the DNA and ligation of oligonucieotidc adapters) 。AFLP 技术革新成功的关键在于DNA 的充分酶切,所以对模板质量要求较高,避免其他DNA 污染和抑制物质的存在。通过热变性对内切酶进行灭活处理,然后在T4 连接酶作用下进行接头连接反应。AFLP 接头是一种人工合成的双链DNA ,一般长度是14～18个核苷酸,目前试剂盒中的接头是EcoRI 接头和MseI 接头,其中报道的6 碱基内切酶接头还有PstI 接头和SacI 接头;4碱基内切酶接头还有TaqI 接头和SseI 接头。 限制性片段的选择性扩增(Selective amplification of sets of restriction fragments) 。选择性扩增前,首先用单选择碱基的引物进行预扩增反应,预扩增产物稀释后用于选择性扩增反应。采用这种两步法为以后的分析提供大量的模板,同时对模板起到选择性纯化的作用,从而使产生的指纹图谱更清晰和具有更好的重复性。 扩增产物凝胶电泳分析(Gel analysis of the amplified fragments) 。扩增产物通常在4 %～6 %的变性聚丙烯酞胺凝胶上分离,然后根据引物的标记物质进行相应的产物检测;也可以采用同位素(r233P)ATP ,T42DNA 连接酶进行末端标记;还可以采用生物素标记。由于AFLP 是扩增反应,所以产生的DNA 量用银染法( silver2staining AFLP) 也足以得到较高的分辨率。 操作程序 基因组DNA的酶切 人工接头的连接 AFLP反应 （1） AFLP反应混合物的制备 （2）预扩增反应 （3）选择性扩增反应 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 （1）5％变性胶的制备 （2）胶板的准备及灌胶 （3）样品的制备 （4）上样 （5）电泳 （6）银染 AFLP 技术的特点 AFLP 结合了RFLP 和RAPD 的优点, 主要表现在: ①AFLP 标记理论上可以无限多, 可覆盖整个基因组, 不需要预知DNA 序列信息, 呈典型的孟德尔方式遗传; ②AFLP技术能高效地检测出DNA 的多态性, 几乎每对AFLP 引物都可以扩增出具有多态性的片段, 一般一次检测可获得50- 100 个AFLP 扩增带; ③DNA 用量少, 且对模板浓度变化不敏感; ④可靠性好,