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* 分子生物学技术在中医药 研究中的应用 上海中医药大学 管冬元、梁超 （2011/6/14） 1.临床研究 中国中医科学院广安门医院吴志奎教授通过大量的临床研究发现，中医补肾生血方药对部分地中海贫血（一种先天遗传性疾病）患者很有效。 问题：哪些患者有效？怎么起效的？ 从分子遗传的角度研究发现，α-地中海贫血是由于基因缺失所致，因此，患者病情重，中医药疗效差；而β-地中海贫血是由于基因突变所致，其中中医药对杂合子基因突变型患者效果明显，对纯合子型或异源双重杂合子基因突变型患者疗效不佳。进一步研究发现，中医药治疗机制并非改变基因突变型，而是促进珠蛋白mRNA的表达。这从基因调控水平上为中医药分型治疗提供了依据。 2.基础研究 复旦大学华山医院中西医结合研究所沈自尹院士开展的系列“肾本质”研究，发现“肾阳虚证”与人体的几大内分泌轴“下丘脑－垂体－肾上腺皮质轴（甲状腺轴、性腺轴）”密切相关，于是将肾阳虚证定位到下丘脑。 问题：下丘脑是如何调控这些内分泌腺的？肾阳虚证有何特点？ 在对下丘脑的基因表达调控研究方面，主要是应用分子生物学技术来加以检测。例如，应用RT-PCR技术发现肾阳虚证与下丘脑室旁核促肾上腺皮质激素释放激素（CRF）的mRNA转录受抑有关。 另外，我国现任卫生部长陈竺院士开展的三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞性白血病的研究 3.针推方面的研究 针刺镇痛的机制研究已深入到分子基因水平，研究证明电针可引起脑内阿片肽基因及其他一些基因表达的变化。韩济生等用原位杂交和Northern blot观察到，注射吗啡6日内大鼠脑内中枢八肽胆囊收缩素（CCK）基因转录逐渐加速，揭示CCK的抗阿片作用是决定针刺镇痛和吗啡镇痛有效性的重要因素。 4.中药研究 1）用于中药种质鉴定或评价，DNA指纹图谱分析。 2）应用分子生物学技术改良中药品质，提高药品质量，中药生物工程，我校胡之壁院士领衔的课题组在这方面做了大量的研究工作。 DNA RNA protein 5 5 1 2 3 4 4 1、转录；2、逆转录；3、翻译；4、调控；5、复制 生物学中心法则图 1．中医药对基因组（DNA）作用的研究 人类基因组计划的人类基因测序工作已经完成。一些实验动物、植物，包括中药植物的测序工作正在展开，或计划展开。 在中医药研究中常用的研究领域为：中医证与基因表型的关系（如SNP）、中医药预防基因突变、中药有效成分相关基因的克隆、中药材的鉴定等。常用的分子生物学技术有：Southern blot、PCR，以及常用的DNA指纹图谱分析技术如ISSR（简单重复序列间区，inter-simple sequence reports）、RAPD（随机扩增的多态性，random amplified polymorphic DNA）、RFLP（限制性片段长度多态性RFLP，Restriction Fragment Length Polymorphism）等。 2．中医药对基因转录（mRNA）水平调整作用的研究 （1）中医药对某个已知基因转录（mRNA）水平调整作用 大量的研究表明，中医药对某一个或一组特定基因的作用是明确有效的，常用的方法有Northern blot、RTPCR、实时荧光定量PCR、原位杂交等。 （2）中医药对基因转录组调整作用的研究 由于中医药是多途径、多靶点作用的特点，因此，近年来，越来越重视中医药基因转录组调控或中医相关证候基因转录组表达特征的研究。常用的研究方法有：cDNA Array、基因芯片（Micro Array）、DDPCR、EST检测等，以及RACEPCR、RNA干扰技术等后续研究工作。 3．中医药对蛋白表达水平的调整作用 （1）中医药对某一已知蛋白表达水平的调整作用 比较常用的方法是ELISA技术、免疫组化和Western blot等技术。还有单克隆抗体制备技术。 （2）中医药对蛋白组表达水平的调整作用 蛋白芯片技术，蛋白双向电泳及其后续的质谱技术。 4．分子生物学中常用的基本技术 （1）基因工程常用技术 （2）细胞培养技术 （3）DNA提取技术 （4）RNA提取技术 （5）蛋白提取技术 （6）分子生物学信息资源的利用 四．本课程的教学安排 包括两个方面，而重在基本技术的操作和培训： 1）理论介绍性的：如实时荧光定量RTPCR，western blot；基因芯片（Micro Array）；PCR技术，免疫组化，以及RNA干扰等技术，。 2）实验操作训练的：如重组质粒、转化宿主细菌、筛选阳性克隆、扩增细菌、从细菌中制备已扩增了的DNA、利用限制性内切酶切开重组插入的DNA片段和载体、电泳分离插入DNA片段和载体、回收插入并放大的DNA基因片段，以及Northern blot录像。 阳性单菌落扩增与小量质粒D