RNAi的实验原理和操作实用技术.pdfVIP

中国试剂网 3.9.65 RNAi 的实验原理和操作实用技术 几十年来生物学上最重要的进展，也许是关于RNA 分子能调节基因表达的 发现。RNA 干涉 （RNAi ）是指双链RNA 分子使基因表达沉寂的现象，是在线 虫中发现的，在 1998 年的一篇Nature 论文中被公诸于众。 此后，科学家们明白，RNAi 还有其他形式，它既是一种了解基因功能的强 大工具，又是很多生物的基因组所采用的一种在演化上来讲很古老的防卫方法。 RNAi 肯定有很多新用途，RNAi 还可能具有一些仍然有待去发现的天然功能。 RNAi 实验原理与方法 近年来的研究表明，将与mRNA 对应的正义 RNA 和反义 RNA 组成的双链 RNA(dsRNA)导入细胞，可以使 mRNA 发生特异性的降解，导致其相应的基因 沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为 RNA 干扰 （RNAi ）。 一、RNAi 的分子机制 通过生化和遗传学研究表明，RNA 干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps) 。在起始阶段，加入的小分子RNA 被切割为21-23 核苷酸长的 小分子干扰RNA 片段(small interfering RNAs, siRNAs) 。证据表明；一个称为Dicer 的酶，是RNase III 家族中特异识别双链RNA 的一员，它能以一种ATP 依赖的 方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA ， 切割将RNA 降解为19-21bp 的双链RNAs(siRNAs) ，每个片段的3’端都有2 个 碱基突出。 在RNAi 效应阶段，siRNA 双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA 诱 导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC ）。激活RISC 需要一个ATP 依赖的将小分子 RNA 解双链的过程。激活的 RISC 通过碱基配对定位到同源 mRNA 转录本上，并在距离siRNA3’端12 个碱基的位置切割mRNA 。尽管切割 的确切机制尚不明了，但每个RISC 都包含一个 siRNA 和一个不同于 Dicer 的 RNA 酶。 另外，还有研究证明含有启动子区的 dsRNA 在植物体内同样被切割成 21-23nt 长的片段,这种dsRNA 可使内源相应的DNA 序列甲基化,从而使启动子失 中国试剂网 3.9.65 去功能,使其下游基因沉默. 二、如何进行RNAi 试验 (一)siRNA 的设计 1. 在设计RNAi 实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选： /business/products/order2.htm /techlib/misc/siRNA_finder.html /Stu/shilin/rnai.html /rnadesign/default.aspx?SID 2.RNAi 目标序列的选取原则： (1)从转录本 （mRNA ）的AUG 起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下 其3端的19 个碱基序列，作为潜在的siRNA 靶位点。有研究结果显示GC 含量 在45%—55%左右的siRNA 要比那些GC 含量偏