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PCR反应体系中各种成分的作用
PCR 反应体系中各种成分的作用
不同模板浓度的实验结果
用相同的引物、两种不同的模板,对6 种不同模板量进行PCR
扩增,发现在模板量25 ng的条件下,扩增产物强度相应减弱,大约
到2 ng左右时无扩增产物;当模板量在25 ng~200 ng之间时,扩
增产物基本稳定,条带清晰、稳定,分辨率高;当模板量200 ng时,
会出现大片段扩增产物的缺失或无扩增产物,且点样孔至泳道会出现
相应增强的弥散背景。综合考虑,在 25μ l的PCR反应体系中,模
板DNA以25~100ng为最适用量。同时模板DNA在200 ng以
下不影响扩增结果,但为降低TE缓冲液中EDTA对反应体系中M
g2+的不良影响程度,应该尽量降低DNA模板用量。
不同Mg2+浓度时实验结果
设置不同Mg2+浓度,当Mg2+浓度为1 0mM时,无PCR扩增
产物;Mg2+浓度为 1 5~2 5mM时,随着Mg2+浓度的增加, PCR
扩增产物带型基本一致,但以2 0mM的扩增效果最好
不同引物浓度对PCR结果的影响
设置5 种不同浓度的引物进行PCR扩增,当引物浓度在0 1~0
2μ M时,扩增结果基本一致;但随着引物浓度的逐渐增加,开始出现
弥散背景增强的趋势,并且有些扩增带发生减弱或缺失。为了保证反
应结果的稳定性和特异性,引物浓度以0 .2μ M左右为宜。
不同dNTP浓度对PCR结果的影响
采用2 种引物(OPB17、OPA16),分别以4 种不同的dNT
P浓度进行PCR反应,发现dNTP浓度在100μ M、150μ M、200
μ M、300μ M时,随着浓度的减小,扩增带明显减少或扩增强度减弱,
当dNTP浓度200μ M时,扩增产物丰富、清晰、带浓,扩增片段产
率与dNTP浓度呈正相关。综合考虑,以100~200μ M的dNTP
浓度为佳。
TaqDNA聚合酶对扩增结果的影响
设置5 个梯度的TaqDNA聚合酶浓度,结果表明随着Taq
DNA聚合酶浓度的增高,扩增产物量呈增多趋势。在0 5 u~2 5 u
浓度间均有扩增产物,但随着TaqDNA聚合酶浓度增加的同时,
弥散背景也相应增强。综合考虑,TaqDNA聚合酶浓度以1 0~1
5 u结果较好
不同退火温度下的扩增效果
引物用OPD16和OPA01,按照优化的PCR反应体系将退火
温度分别设置为 33℃、36℃、39℃、42℃。结果表明随着退火温度
降低,非特异性产物增加,有弥散背景;退火温度升高,特异性相对增
加。
Mgcl2 与dNTP互相作用及对PCR反应的影响 用
同一引物OPD07、相同模板DNA比较3 种Mg Cl2 浓度与 3
种dNTP浓度完全随机相结合的9 个处理的PCR结果,研究了M
gcl2 与dNTP的相互作用。结果表明,Mgcl2 在低浓度时,
过量的dNTP对Mg2+的螯合作用明显,表现为降低Mg2+的酶催
作用, PCR扩增产物减少或无,而低量的dNTP对Mg2+酶催的
抑制作用减少, PCR扩增产物增多。在高浓度Mgcl2 浓度下, d
NTP无抑制作用。在相同Mg2+离子浓度和足量dNTP时,扩增
产物相似。1-9 泳道分别代表Mgcl2(mM)/ dNTP(μ M)的浓
度(1/100、1/200、1/300、2/100、2/200、2/300、3/100、3/200、
3/300)。
PCR 反应体系与反应条件
标准的PCR 反应体系:
10×扩增缓冲液 10ul
4 种dNTP 混合物 各200umol/L
引物 各10~100pmol
模板DNA 0.1~2ug
Taq DNA 聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100ul
PCR 反应五要素:参加PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、
模板和Mg2+
引物: 引物是PCR 特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决
于引物与模板DNA 互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA
序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR
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