动物细胞的培养条件与培养基.ppt

第四节 动物细胞的培养条件和培养基 细胞体外培养基本条件: ①无菌 ②营养充足,防止有害物质 ③氧气 ④随时清除代谢有害物质 ⑤良好的生存外环境 ⑥及时分种 一、动物细胞的培养条件 ⒈器材的清洗和消毒 ⑴器材的清洗 浸泡、刷洗、泡酸、冲洗 ⑵器材的消毒灭菌 物理消毒 化学消毒 ⒉ 水质 :电阻值大于18MΩ,去热原。 ⒊ pH:7.2～7.4 ⒋ 渗透压:290～300mOsm/kg ⒌ 温度:37±0.5 C ⒍ 空气:氧的饱和质60%,氧分压4～0.7kPa 二、动物细胞的培养基的种类和组成 分3类: ⒈天然培养基 ⒉合成培养基 ⒊无血清培养基 ⒈天然培养基 血清、羊水、腹水等,成分复杂、成分不稳定 ⒉合成培养基 DME、 MEM、 DMEM、 HAM F12、RPMI1640 ⑴氨基酸 ⑵维生素 ⑶糖类 ⑷无机盐 ⑸其它成分 如：添加小牛血清 添加小牛血清的作用 ⑴提供生长因子和激素 ⑵提供贴附因子和伸展因子 ⑶提供结合蛋白 ⑷提供必需脂肪酸和微量元素 ⒊无血清培养基 ①提高重复性 ②减少微生物污染 ③供应充足稳定 ④产品易纯化 ⑤避免血清因素对细胞的毒性 ⑥减少血清中蛋白对生物测定的干扰 无血清培养基加入添加剂 ⑴生长因子和激素 ⑵结合蛋白 ⑶贴附因子和伸展因子 ⑷有利细胞生长的因子和元素 一 细胞分离 1. 离心分离法 2. 消化分离法 二 细胞计数 1. 自动细胞计数器计数 2. 血球计数板计数 3. 结晶紫染色细胞核计数法 4. MTT染色计数法 三 细胞传代 1. 悬浮细胞传代 2. 贴壁细胞的传代 四 细胞的冻存和复苏 1. 细胞的冻存 2. 细胞的复苏 第六节 动物细胞大量培养的方法和操作方式 一、动物细胞大规模培养的方法 ⑴微载体培养 ⑵包埋和微囊培养 ⑶结团培养 二、动物细胞培养的操作方式 ⒈分批式操作 ⒉半连续式操作 ⒊灌流式操作 第七节 动物细胞生物反应器及其检测控制系统 一、动物细胞生物反应器的类型及其基本结构 ⒈搅拌式生物反应器 ⒉气升式生物反应器 ⒊中空纤维式生物反应器 ⒋透析袋或膜式生物反应器 ⒌固定床或流化床式生物反应器 ⒈搅拌式生物反应器 ⒉气升式生物反应器 ⒊中空纤维式生物反应器平床式中空纤维式生物反应器⒋透析袋或膜式生物反应器 ⒌固定床或流化床式生物反应器 CellGen plus生物反应器 二、动物细胞生物反应器的检测控制系统 ⒈ 培养过程需检测的物化参数 直接在线检出 取样离线检测 检测后计算 ⒉ 主要参数的检测和控制方法 ⒉主要参数的检测和控制方法 ⑴ 温度 ⑵ pH ① 在培养初期，控制进氧量 ② 当细胞密度提高后控制NaHCO3的量 第八节 动物细胞产品的纯化方法和质量要求 一 动物细胞产品的常用纯化方法 1. 离心 2. 离子交换层析 3. 凝胶过滤 4. 亲和层析 5. 盐析和有机溶剂沉淀 6. 透析 7. 高压液相层析 二 动物细胞产品的质量要求 1. 对工程细胞的要求 2. 对生产工艺的要求 3. 对产品的质量要求 第九节 动物细胞产品的制造实例 一 类淋巴细胞干扰素 二 组织型纤溶酶原激活剂 三 单链尿型纤溶酶原激活剂 四 促红细胞生成素 五 凝血因子Ⅷ 第十节 动物细胞制药的前景与展望 一、提高产量降低成本和改进质量方面 的研究 二、转基因动物的研究 三、组织工程的研究 一、提高产量、降低成本和改进质量方面的研究 为了提高产量,要提高细胞表达水平。 为降低成本，须改进培养基配方。 为改进产品质量，关键是糖基化质量。 改进工艺，生产设备等 二、转基因动物的研究 自1982年Palimiter提出用转基因动物来生产药用蛋白以来，发展迅速。 优点：产量高成本低质量与天然一样。 现还有不成熟之处。 对动物和人的健康的影响。 三、组织工程的研究 组织工程：通过对大量细胞的培养，并用细胞直接作为一种治疗手段用于临床，或用培养的细胞进一步加工构成一种组织，如人造皮肤、人造肝脏、人造胰腺、人造血管、人造骨等并用于临床治疗。 * * 第五节 动物细胞培养的基本方法 动物细胞大规模培养的方法： 依细胞种类: 原代培养、传代培养 依培养基: 液体培养、固体培养 依培养器和方式: 静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定床或流化床培养 生产实际分为： 悬浮培养，贴壁培养，贴壁-悬浮培养 ⒈悬浮培养 让细胞自由的悬浮于培养基内生长繁殖。 ⒉贴壁培养 让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。 ⒊贴壁-悬浮培养 ⑶溶氧