实验五 DNA的粗提取与鉴定.pptVIP

实验五  DNA的粗提取与鉴定 一、目的要求： 二、实验原理 三、实验材料及用具 四、实验步骤 DNA的鉴定 五、注意事项 六、讨论 香蕉DNA的粗提取与鉴定 * 1. 了解实验原理。 2. 学会DNA的粗提取和鉴定的方法，观察提取出来的DNA物质。 3．通过本实验培养实验操作能力和观察能力。 1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。 当NaCl的物质当量浓度为0.14 mol／L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。 　　2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。 　　3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 鸡血细胞液（5～10 mL）； 95％的冷酒精， 0.1 g／mL的柠檬酸钠溶液， 2 mol／L和0．015 mol／L的NaCl溶液，二苯胺试剂，蒸馏水； 烧杯（100 mL 1个， 50 mL、500 mL 各2个），漏斗，试管（20 mL 2个），玻璃棒，滴管，量筒（10ml、25ml、50ml、100 mL 、200ml各1个），纱布，镊子，滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，试管夹。 离心得鸡血细胞液5?mL～10mL 加蒸馏水 50～100mL（10倍） 充分搅拌5～10?min 单层纱布的漏斗将血细胞液过滤 滤液中加 2?mol/L氯化钠溶液80～150mL 缓缓加入蒸馏水至粘稠物不再增加 充分摇动烧杯 4～5层纱布（或单层擦镜纸）的漏斗过滤 钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至?20mL?2?mol/L氯化钠溶液中 搅拌溶解 两层纱布的漏斗过滤 加入冷却的体积为滤液2倍的95％酒精 玻璃棒搅拌卷起丝状物 DNA的鉴定 取两支20?mL的试管，各加入浓度为0.015?mol／L氯化钠溶液5?mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热?5?min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。 1．制备鸡血细胞液时，要在取新鲜鸡血的同时加入抗凝剂，使血液分层，取下层血细胞沉淀。 2．获取较多DNA的关键是向鸡血细胞液加入足量的蒸馏水，以便使细胞膜和核膜破裂，核内物质释放出来。 3．实验中共有3次过滤。过滤时使用的纱布层数与取其滤液或黏稠物有关。第1、3次要用其滤液，使用的纱布为1—2层，第2次是要用其滤出的黏稠物，使用的纱布为多层。 4．实验中有5次搅拌，除最后一次搅拌外，前4次搅拌均要朝向一个方向，并且在析出DNA、DNA再溶解和提取中，各步搅拌都要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，防止DNA分子断裂。 5．实验中有两次使用蒸馏水。一次在第1步，加水是为了使血细胞吸水膨胀破裂，加水后必须充分搅拌，不应少于5min，使血细胞充分破裂；第二次加蒸馏水是在第3步，加水是为了稀释氯化钠溶液。 6．实验中有三次加氯化钠溶液。在步骤2中，当加入氯化钠后，必须充分晃动烧杯，使二者混合均匀，加速染色质中DNA与蛋白质分离，使DNA充分游离并溶解在氯化钠溶液中。在步骤5中，加氯化钠溶液也是为了DNA的再溶解，不过这时溶液中蛋白质含量已很少。在步骤8中，加的NaCl溶液的浓度比前2次低的多，但还是为溶解DNA。 7．在步骤7中，必须使用冷酒精(至少在5℃以下存放24h)，并且将1份含DNA的NaCl溶液加入到2份的冷酒精中。如果悬浮在溶液中的DNA丝状物较少，可将混合液放入冰箱中再冷冻几分钟。 8．盛放鸡血细胞液的容器和实验中的烧杯和试管最好也是塑料制的，因为玻璃制品表面带电荷，DNA中的磷酸基带相反的电荷，会被吸附于玻璃表面，减少DNA含量。 9．本实验成功的关键，是保证提取到足量且较纯净的DNA。因为DNA在细胞中含量少，所以在下列步骤中应特别注意：在步骤1中使用的鸡血的量要在5mL以上。提取细胞核物质时要充分搅拌5min以上。在步骤2中要充分晃动烧杯，在步骤3中加蒸馏水要控制好量，同时应用玻璃棒缓缓搅动使DNA聚集其上。在第4步中要使用多层纱布过滤，在第5步中要充分搅拌，在第7步中使用冷酒精。 1．提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液中的上清液？????2．步骤1和步骤3中都需要加入蒸馏水，两次加入的作用相同吗？为什么？ *