实验九酵母蔗糖酶的提取和纯化.pptVIP

* 实验九 酵母蔗糖酶的提取与纯化 实验原理 　　本实验提取酵母中的蔗糖酶，该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，分别称为外蔗糖酶和内蔗糖酶，其中外蔗糖酶占酶活力的大部分，两种酶在组成上有较大的区别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。通过细胞破碎、热处理、乙醇沉淀等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。 一、酶的提取 操作步骤 １.破碎细胞 　　取约10g干酵母和5克石英砂，加20ml甲苯，在研钵中磨成糊状。然后每次加15ml水，研磨10分钟左右，共3次，使其呈糊状。将研磨好的内容物转移到80ml离心管中，平衡后以12000rpm离心15分钟。 ２.抽提 　　用吸管小心将离心后的中间水层转移到干净的离心管中，勿带上层甲苯相，然后以12000rpm离心10分钟。将离心后的上清液取出，倒入量筒中记录其体积（V1），留下1.5ml作为第一组分（粗抽提液）以备酶活力和蛋白浓度测定。 ３.热抽提 　　将1mol/L醋酸逐滴加进粗酶液，记录几滴醋酸，调pH至5.0。然后迅速放入到50℃的水浴中，保温30分钟，在温育的过程中经常缓慢摇动试管或搅拌抽提液。之后在冰浴中迅速冷却之，12000rpm离心15分钟，弃去沉淀。量出上清液体积并记录之（V2），留下2ml（2管）作为第二组分（热抽提液）以备酶活力和蛋白浓度测定。 ４.乙醇沉淀 　　在第二组分中加入等体积的95%冷乙醇，冰浴并温和搅拌20分钟。然后以12000rpm离心15分钟，小心弃去上清，沉淀沥干。将沉淀溶解在10ml的pH7.3，0.05mol/LTris-HCl缓冲液中，搅拌使其完全溶解（5分钟以上），以12000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清液作为第三组分（乙醇抽提液）。量出上清液体积（V3），留下3ml（3管）以备测定酶活力和蛋白质浓度。并用膜封口，保存于冰箱中供后面实验。 *