大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选.docVIP

大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选 一、实验原理 在以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理细菌，使基因发生突变，丧失合成某一物质（如氨基酸、维生素、核苷酸等）的能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长。这样从野生型经诱变筛选得到的菌株，称为营养缺陷型。筛选营养缺陷型菌株必须经过以下几个步骤：诱变处理、淘汰野生型、检出缺陷型、鉴定缺陷型。由于本实验是以大肠杆菌为材料，所以根据细菌的特性分别说明筛选的步骤。 诱变剂的作用主要是提高突变频率，它分为物理和化学的二类。物理诱变剂常用的有X射线、紫外线、快中子、γ射线等诱变处理首先是选择诱变剂，微生物诱变中最常用的物理诱变剂是紫外线。 诱变剂所处理的微生物，一般要求呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液，分布均匀，这样可以避免出现不纯的菌落。用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，那时的细菌对诱变剂的反应最灵敏。 诱变处理必须选择合适的剂量，剂量的表示有二种，绝对剂量和相对剂量。绝对剂量的单位以尔格/cm2表示，一般用相对剂量。相对剂量与三个因素有关，这三个因素是：诱变源和处理微生物的距离，诱变源（紫外灯）的功率，以及处理的时间。前二个因素是固定的，所以通过处理时间控制诱变剂量。各种微生物的处理最适剂量是不同的，须经预备实验确定。 经处理以后的细菌，缺陷型还是相当少的，必须设法淘汰野生型细胞，提高营养缺陷型细胞所占比例，以达到浓缩缺陷型的目的。细菌中常用的浓缩法是青霉素法。青霉素是杀菌剂，它只杀死生长的细胞，对不生长的细胞没有致死作用。所以在含有青霉素的基本培养基中野生型能长而被杀死，缺陷型不能长被保存得以浓缩。 检出缺陷型的方法有逐个测定法、夹层培养法、限量补给法、影印培养法。这里主要以逐个测定法为例进行说明。把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全培养基上，待长出菌落后将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上。凡是在基本培养基上不能生长而在完全培养基上能长的菌落就是营养缺陷型。 经初步确定为营养缺陷型的菌用生长谱法鉴定。在同一培养皿上测定一个缺陷型对多种化合物的需要情况。 二、实验材料 大肠杆菌K12的野生型菌株大肠杆菌（Escherichiacoli）K12SF+。 三、实验器具和药品 1.用具：灭菌培养皿（9厘米），灭菌三角烧瓶（150毫升），灭菌吸管（1.5毫升），灭菌离心管。 2.培养基： （1）肉汤液体培养基：牛肉膏0.5克，蛋白胨1克，NaCl0.5克，蒸馏水100毫升，pH7.2，高压灭菌15磅/英寸215分钟。 （2）肉汤液体培养基（ZE）：牛肉膏0.5克，蛋白胨1克，NaCl0.5克，蒸馏水50毫升，pH7.2，高压灭菌15磅/英寸215分钟。 （3）基本液体培养基：Vogel50×2毫升，葡萄糖2克，蒸馏水98毫升，pH7.0，高压灭菌8磅/英寸230分钟 （4）基本固体培养基：琼脂2克，基本液体培养基100毫升，pH7.0，高压灭菌8磅/英寸230分钟。 （5）无N基本液体培养基：K2HPO4O.7克（或K2HPO4·3H2O0.92克），KH2PO40.3克，柠檬酸钠·3H2O0.5克，MgSO4·7H2O0.01克，葡萄糖2克，蒸馏水100毫升，pH7.0，高压灭菌8磅/英寸230分钟。 （6）2N基本液体培养基*：K2HPO40.7克（或K2HPO4·3H2O0.92克），KH2PO40.3克，柠檬酸钠·3H2O0.5克，MgSO4·7H2O0.01克，（NH4）2SO40.2克，葡萄糖2克，蒸馏水100毫升，pH7.0，高压灭菌8磅/英寸230分钟。 （7）混合氨基酸和混合维生素及核苷酸的配制：氨基酸（包括核苷酸）分7组（I—Ⅶ），其中6组（I—VI）每组有6种氨基酸（包括核苷酸），每种氨基酸（包括核苷酸）等量研细充分混合。第7组是脯氨酸，因为这种氨基酸容易潮解，所以单独成一组。 把维生素B1、B2、B6，泛酸，对氨基苯甲酸（BAPA），烟碱酸及生物素等量研细，充分混合，配成混合维生素。 3.生理盐水：NaClO.85克，蒸馏水100毫升，高压灭菌15磅/英寸215分钟*。 四、实验说明 微生物中筛选营养缺陷型的步骤包括诱变处理、淘汰野生型、检出缺陷型、鉴定缺陷型四步。由于不同微生物和诱变剂的特性差异，所以在实际工作中，应根据具体情况而适当变动，现分别补充说明。 当选用化科诱变剂进行诱变处理时，首先应根据诱变剂的特性，确定用何种诱变剂。化学诱变剂根据它们的诱变作用可以区分为三种：1.通过掺入DNA分子而引起突变，必须通过代谢作用。属于这一类的诱变物质如碱基类似物。2.通过和DNA直接起化学反应而引起突变。多数化学诱变剂属于这一类如亚硝酸等。3.通过一对核苷酸的插入或缺失而引起突变如吖啶类物质。 化学诱变剂的剂量也以相对