专题 PCR 添加剂.docVIP

【专题】PCR添加剂简介1.3 PCR添加剂研究概述PCR添加剂是PCR反应中的一种增效剂，它们在PCR反应中起到提高PCR反应的特异性、增加PCR扩增的产量及防止无效扩增等有益效果。由于PCR技术在有些情况下扩增的不完美性，从PCR技术发明的初期开始，人们就展开了对PCR反应中添加其它化学物质的研究。迄今为止，在PCR添加剂的研究领域，人们已经发现了越来越多的PCR添加剂，它们都以各自的特性在不同的方面对PCR反应起着促进作用。而随着PCR添加剂研究的不断发展，在各种相关研究中，人们逐渐从研究和应用单一型PCR添加剂转向研究和应用复合型PCR添加剂，从传统PCR添加剂的研究开发转向新材料新化合物PCR添加剂的研究开发。传统的PCR添加剂包括常见的助溶剂、离子化和非离子化的除垢剂以及一些诸如氯化四甲基铵（TMAC）、甜菜碱、SSB等。多年来人们对这些添加剂的研究表明，它们在一定的浓度范围内对某些PCR有着增效作用，但在另外一些情况下或在其它的浓度范围内对PCR反应又有着抑制作用，所以这些PCR添加剂的在不同反应体系中的应用应通过试验来调整和合理选择，合理准确的使用会使PCR反应获得很大的改善，从而得到试验所需要的理想结果。甜菜碱是一种高效的甲基受体，它在一些细菌体内对抵抗因盐份引起的渗透压升高起着重要的作用，其做为一种PCR添加剂，出现在Rees.W.A.[22]等人对甜菜碱降低DNA 的Tm所做的研究之后。甜菜碱广泛存在于多种酶以及PCR试剂盒中，它能提高PCR扩增的效率和特异性，特别是在长PCR（Long-PCR）扩增时常被应用[23]。Barnes[23]指出，在Long－PCR中添加甜菜碱能够使每个循环的热变性温度下降到92℃～93℃，且退火温度也可以下降1℃～2℃，从而补偿因退火条件变化及因其它添加剂引起的酶稳定性下降引起的PCR反应的负面效果。另外，他还指出甜菜碱不仅能促进高GC含量片段的扩增，而且能提高普通的PCR扩增的目的产物量[24]。甜菜碱另外一个优点是，作为一种渗透保护剂，它具有和牛血清白蛋白（BSA）类似的功能，能够防止聚合酶的变性[24]。把Long－PCR Buffer中的BSA换成甜菜碱将有利于减少弥散问题的发生。甜菜碱也有可以克服DNA少量污染带来的扩增困难，这意味着PCR反应可以在低质量模板存在的情况下进行[25]。氯化四甲基铵（TMAC）最早被用于在杂交反应中减少DNA／RNA的错配以提高特异性[26]，在PCR反应中，它能够增加PCR反应的效率和提高PCR反应的特异性。在Ted Hung等人[27]首次发现TMAC提高PCR反应特异性的研究中，他们选择了两个mouse cDNA的基因片段进行扩增实验。结果显示，含有1×10-5～1×10-4 M TMAC的实验组扩增结果在电泳图上只出现一条单一的目的条带，而未含有TMAC的实验组特异性非常差，有多条非目的条带出现。Eric Chevet等人[28]在研究中还发现，通过添加TMAC可以提高AT含量丰富的DNA片段的Tm，从而通过改善引物的特异性结合来提高PCR反应的特异性。在研究中，他们实验了不同浓度的TMAC促进PCR反应的效果，发现TMAC的最佳添加浓度为60mM。他们的研究还表明，TMAC不仅可以提高PCR反应的特异性，而且可以提高PCR反应的效率，三对引物的扩增实验均发现添加TMAC可以提高PCR目的产物产量5～10倍。单链结合蛋白（SSB）是活的生物体中不可缺少的重要物质，它非特异性的和单链DNA结合，参与所有涉及到单链DNA的诸如复制，修复及重组等过程[29]。这种体内DNA复制过程中SSB所起到的重要作用，自然引起了人们对SSB在PCR这一体外DNA 复制技术中应用的可行性考虑。Rapley等人[30]在1994年首次就SSB在PCR中的应用做了专门研究。他们研究发现T4噬菌体基因32编码蛋白及大肠杆菌单链结合蛋白对数种模板的PCR反应均有提高效率的作用。由于PCR反应是一个不断的热循环过程，因此嗜热源SSB是PCR添加剂的理想来源，这一点在近年来的研究中得到了证实。D等[12]就曾克隆Thermus aquaticus 和 T.thermophilus的SSB编码基因并让它们在E. coli中过表达，随后进行的Taq SSB及Th SSB在PCR中的添加实验表明它们均能很好的提高PCR反应效率。之后不久，Perales等人[13]表达纯化了三种类型ThSSB，在Th聚合酶和Pfu聚合酶的PCR体系中所做的实验发现ThSSB可以使PCR延伸的时间减半，而且在无校正功能的Th聚合酶PCR体系中的实验进一步表明ThSSB可以增加PCR反应的保真度。而Olszewski等人[14]在multiplex PCR 实验中对