00酶切法制备T载体.docVIP

T载体的制备 主要阶段： 一：重组T载体质粒的构建 二：重组T载体质粒大量制备 三：酶切T载体质粒制备T载体 四：克隆效率检测 一：重组T载体质粒的构建 设计扩增Lambda基因约1KB左右的PCR引物，PCR区域内Lambda基因不能有Kpn I, BamH I,Xcm I的酶切位点。序列如下： T-VEC-F: GCTCGGTACCTCGCGAATCCATCTATCTGCTGGGTGTTTATGC T-VEC-R: GGATTGGATCCCATATCTTTGATGGCCTCATCCAC PCR扩增Lambda基因。 Lambda genome 0.5ul 100uM Primer F 0.5μl 100uM Primer R 0.5μl dNTP 1μl 10xTaq buffer 5 μl Taq 0.5μl H2O 42μl Total 50μl体系 PCR仪器95度3分钟预变性，95度15秒，57度15秒，72度20秒，25个循环。 点琼脂糖回收。图如下： pUC57，Lambda－1KB片段Kpn I, BamH I双酶切。 PUC57体系 PUC57 (230ng/μl) 10μl 10Xbuffer K 2.5μl Kpn I 3μl BamH I 2μl H2O 32.5μl Total: 50μl 37℃ 2h Lambda－1KB片段体系 Lambda－1KB (108ng/μl) 80μl 10Xbuffer K 5μl Kpn I 3μl BamH I 2μl H2O 10μl Total: 100μl 37℃ 2h 酶切完成后Binding I回收。 PUC57 酶切回收40ul，48ng/ul. Lambda－1KB片段 酶切回收80ul，86ng/ul. pUC57、Lambda－1KB酶切链接 L-1K（86ng/μl） 5μl PUC57(46ng/μl) 2μl PEG3000 5μl 10xligase buffer 2μl T4 ligase 1μl ATP(10mM) 1μl H2O 4μl Total?:20μl体系 室温连接5－20分钟。 热激转化，涂菌： 1.10μl连接产物加入100μl感受态，混匀，置于冰上10min 2.42℃热激90s，置冰上2-3min 3.加入LB600μl，摇45-60min 4、5000rpm，3min，吸出上清500μl 5.涂板，先涂X-gal:IPTG= 40:10,涂菌，37℃倒置培养过夜。 菌落PCR检测插入片段 挑白色菌落，37℃，230rpm进行摇菌 菌液： 3μl 50uM Primer F(M13+) 0.4μl 50uM Primer F(M13-) 0.4μl dNTP 0.3μl 10xTaq buffer 3 μl Taq 0.3μl H2O 22.6μl Total 30μl体系 设空白质粒做对照 95℃ 3min 95℃ 20s 57℃ 20s 72℃ 20s 20循环 72℃ 5min 点琼脂糖检测，如图： 送前5个测序。 测序结果： 5端： 3端： 二：重组T载体质粒大量制备 按1：100 比例转接，37