血清蛋白质醋酸纤.ppt

血清蛋白质醋酸纤  维素薄膜电泳 2010-10-26 汪昭旋 黎小龙 李刚奇 赵亚军 实验目的： 掌握电泳的基本原理，了解电泳仪﹑电泳槽的基本结构与功能。 熟悉电泳的基本过程与定量方法。 熟悉血清电泳在临床诊断中的作用。 1、电泳（electrophoresis）法 带点粒子在直流电场中向着相反电极移动的现象称为电泳。 电泳原理：在一定pH条件下，不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离。 影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象 影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状 常见的电泳技术： 1.醋酸纤维膜电泳 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳 3.琼脂糖凝胶电泳 4.等电聚焦电泳 5.双向电泳 采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。 醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄膜，其厚度为0.1～0.15mm 优点： 1.吸附作用小 2.电渗作用小 3. 需加样量少 4. 亲水性小 实验试剂 巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6、I=0.06) 氨基黑10B染色液：氨基黑10B 0.25g，用甲醇50mL、冰醋酸10mL、水40mL溶解（可重复使用）。 漂洗液：甲醇45ml、冰醋酸5ml和蒸馏水50ml，混匀。 实验操作流程 薄膜的准备 电泳槽的准备 点样 电泳 染色与漂洗脱色 操作步骤： 准备：将巴比妥缓冲液加入电泳槽的电极 室内，使正负极室的液面等高，电泳支架宽度正好适合醋纤薄膜的长度，用四层纱布或滤纸做盐桥，一端浸入缓冲液中，一端搭在支架上。 膜的预处理：将薄膜切成2×8cm，先于膜条无光泽面距一端1.5cm处用铅笔轻划一直线(点样线)，再将薄膜无光泽面向下浸泡于巴比妥缓冲液中，浸透为止（30min)。取充分浸透的膜条，将薄膜无光泽面向上，滤纸吸取多余的缓冲液，不要吸太干。 3. 加样：用滴管吸取待测血清一滴于玻璃片上，用点样器末端处蘸取少许样品，垂直轻印（迅速均匀）到薄膜点样线上，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。 此步是实验的关键：以印章法加样时，动作应 轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄破或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。点样前可先在滤纸上反复练习，掌握点样技术后再正式点样。 4.平衡：待血清渗入薄膜后，将膜条无光泽面向下置于电泳槽支架上，点样端靠近负极，薄膜两端要紧贴滤纸（点样线不要压在滤纸上），中间平直悬空，加盖密封，平衡5分钟。 5. 电泳：将电泳槽正负极分别与电源正负极接好。开启电源，调节电流密度为0.5mA/cm，如有10条宽2cm的膜条，其总宽度为20cm，应使用电流强度为20cm×0.5mA/cm＝10mA。电压15V/cm。通电50分钟左右，关闭电源。 6. 染色和漂洗：取下薄膜直接浸于氨基黑10B染色液中，染色5分钟后取出，先用自来水漂洗1-2次，然后用漂洗液漂洗3～4次，至背景完全无色为止。 7.定量 （1）洗脱比色：将各蛋白质区带仔细剪下，分置各试管中，另从空白背景剪块平均大小的膜条置于空白管中。各管加入0.4mol/l NaOH 4ml,于37℃水浴20分钟（不时振荡），待颜色脱净即用波长620nm比色，以空白管调零读取各管吸光度。 （2）计算: 吸光度总和（T） =A+α1+α2+β+γ（吸光度） ? ? 血清蛋白组分的相对百分数： A%=A/T×100% T—吸光度总和 α1%=α1/T×100% α2%=α2/T×100% β%=β/T×100% γ%=γ/T×100% 临床意义： 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳，通常可分离白蛋白(Alb)、α1、α2、β和γ-球蛋白五个组分，正常人血清中各种蛋白质浓度的差别较大，所以在许多疾病时仅表现出轻微变化，往往没有特异的临床诊断价值。 分析几种疾病的电泳分析结果，可以看出较显著的变化。 典型异常血清蛋白电泳图谱 在异常电泳图谱中，肾病综合征、肝硬化和多发性骨髓瘤(M蛋白血症型)最具有特征性，在临床上诊断意义最大。 几种疾病的蛋白电泳变化 思 考 题： 问答题 1.CAME的基本原理是什么？ 2.CAME分离血清蛋白电泳时应注意哪些问题？ * * + 白蛋白(A) α1 α2 β γ 实验原理：血清蛋