报告：纸电泳和醋酸纤维.ppt

(一)、纸电泳的原理、操作及其应用 (二)、醋酸纤维薄膜电泳： 原理 特点 应用：血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 电泳图谱 异常及其原因 注意事项 纸电泳和醋酸纤维素薄膜电泳 制作小组成员：（9~16号） 李敏、周瑞、肖阳、王超、陆瑶、谭茹瑜、刘倩、刘忠志 纸电泳 纸电泳是根据电泳现象在渗透了缓冲液的滤纸加上电场使物质移动的电泳法。（也就是把样品以带状加在作为支持体的滤纸内来检测其移动和分离的方法。） 常用以分离性质相似的物质，如各种氨基酸的分离和稀土元素的分离等。 纸电泳原理 纸电泳是利用纸作为支持物，使带电微粒在纸上电泳，从而达到分离的一种方法。 将样品点在用缓冲液浸湿的滤纸上，将滤纸放在电泳槽的支架上，滤纸的两端浸在缓冲溶液里，接通电源，纸的两端就有一定的电压，吸引带电颗粒在纸上移动。 氨基酸在其等电点时以兼性离子存在，若溶液的pH低于氨基酸的等电点（pH﹤pI），则氨基酸分子带有正电荷（Aa+），电泳时向负极移动；若溶液的pH高于等电点（pH﹥pI），氨基酸分子带有负电荷（Aa-）,电泳时向正极移动。电泳过程中，由于电极反应会使连接正极和负极的电解液的pH向相反方向变化，所以应用缓冲溶液以保持pH相对稳定。 另外，选用挥发性的缓冲溶液较好，因为电泳后滤纸烘干时容易除去，以减少对显色的影响。 纸电泳操作要点 1、选择缓冲液对显色剂和紫外光吸收等观察区带的方法无影响 A : 分离蛋白质，pI≈ 5，选pH8.6的缓冲液（巴比妥缓冲液pH8.6、硼酸pH8.6、磷酸pH7.4) B: 分离氨基酸：邻苯二甲酸氢钠、磷酸—醋酸，pH5.9 C:分离核苷酸巴比妥－醋酸pH2.5，柠檬酸pH2~3 D: 分离糖类：HAC-NaAC, pH3~5 2 、滤纸的选择与处理 层析用滤纸，纸宽2～3cm/样品组分，长短影响 电场强度。 3 、点样 点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知 样品）、点一边（已知样品） 干法、湿法 4 、电泳 电桥水平、加盖、电压稳定、注意时间 5 、显色及分析 蛋白：溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红B Aa：茚三酮、靛红 核酸：紫外光下观察 一般洗脱定量 纸电泳的操作注意事项 1．点样应在滤纸的一端距纸边２－１０cm处。样品可点成圆形或长条形，长条形的分离效果较好。点样量为５－１０微克和５－１０微升。点样方法有干点法和湿点法。 （湿点法是在点样前将滤纸用缓冲液浸湿，样品液要求较浓，不亦多次点样。干点法是在点样后再用缓冲液和喷雾器将滤纸喷湿，点样时可用吹风机吹干后多次点样，因而可以用较稀的样品。 ） 2．严禁空载，空载易造成电泳仪损坏，只有高级双稳（能控制电流强度和电压）电泳仪才提供空载保护。 3．电泳完毕后，应先关闭电源，再拔小插头，以免触电。在仪器接通电源工作期间，严禁接触电泳槽电极、电极插头和电泳物等，严禁输出电极与地短路，以免破坏仪器。仪器不许空载运行，防止震动，使用环境应保持干燥，应无腐蚀性气体存在。 纸电泳的应用 纸电泳的设备简单，应用广泛，是最早使用的一种电泳技术。 最初用于蛋白质，后来也用于氨基酸、核苷酸一些低分子物质，其优点在于或采用滤纸与色素结合的直接电泳图，或剪下滤纸的任何部分来抽提其中的物质。 在早期的生物化学研究中，曾发挥重要作用。由于纸电泳时间长，分辨率较差，近年来逐渐为其他快速、简便、分辨率高的电泳技术所代替。 一、醋酸纤维薄膜电泳原理 醋酸纤维素薄膜电泳是利用醋酸纤维素薄膜做固体支持物的电泳技术。 醋酸纤维薄膜具有匀一的泡沫状结构（厚约 120 μ m ），渗透性强，对分子移动无阻力，用它做区带电泳的支持物，用样量少，分离清晰，无吸附作用，应用范围广和快速简便 , 且染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明，透明后的薄膜便于保存和定量分析。 二、醋酸纤维薄膜电泳特点 1、（1）醋酸纤维素薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了测定的精确性。?　　 （2）快速省时。由于醋酸纤维素薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45—60min即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需90min左右。?　　 ?　（3）灵敏度高，样品用量少。?血清蛋白仅需2μl血清，甚至加样体积少至0.1μl，仅含5μg蛋白样品也可得到清晰的分离带。临床医学检验利用这一点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。 （4）应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。?